C3H/Heマウス(雌、6〜9週齢)の脾臓CD4陽性T細胞を分離し、biotin標識抗B7-1、抗B7-2抗体とphycoerithrin-avidin(PE-avidin)で染色し、さらにナイーブ/メモリーT細胞のマーカーである、CD44もしくはCD45RBに対する蛍光色素(FITC)標識した抗体で染色した。この細胞をflow cytometryにて解析し、CD44低発現ナイーブT細胞とCD45RB低発現メモリーT細胞のそれぞれの細胞集団上のB7-1/B7-2の発現について検討した。

　CD44低発現T細胞はB7-2をほとんど発現していなかったが、CD45RB低発現T細胞は強くB7-2を発現していた(図1)。B7-2の発現量をMean fluorescent intensityで比較すると、CD44低発現T細胞は4.69、CD45RB低発現T細胞では47.40であった。一方、B7-1の発現は、CD44低発現、CD45RB低発現T細胞でともに認められなかった(図1)。この結果、B7-2分子はCD45RB低発現のメモリーCD4陽性T細胞上に発現されていること、B7-1分子はいずれのCD4陽性T細胞にも発現していないことが明らかになった。

図1 ナイーブ並びにメモリーCD4陽性T細胞上のB7-1分子とB7-2分子の発現分離した脾臓CD4陽性T細胞をbiotin化抗B7-1、抗B7-2抗体とPE-avidinで染色し、さらにFITC標識抗CD44、抗CD45RB抗体で染色した。CD44低発現並びにCD45RB低発現の細胞集団のB7-1とB7-2の発現をflow cytometryにより解析した。Controlとしては同一Igサブクラスの抗CD8抗体を用いた。

　さらに、脾臓CD4陽性T細胞から、CD44低発現、CD45RB低発現T細胞をそれぞれ分離し、RT-PCRを用いてB7-1とB7-2のmRNAの発現を解析した。B7-2のmRNAはCD45RB低発現T細胞で強く発現されているのに対して、CD44低発現T細胞では極弱くしか発現されていなかった。B7-1のmRNAはCD45RB低発現T細胞でごくわずかに発現が認められただけだった。このようにmRNAの発現は、前述の染色による細胞表面の発現の解析結果と一致した。

　また、抗原提示細胞上のB7-2分子はT細胞上のCD28分子と結合して副刺激分子として働くことが知られている。マウスCD28分子とヒトイムノグロプリンとの融合蛋白の、CD44低発現並びにCD45RB低発現CD4陽性T細胞に対する結合をFACSにて解析した。結果、CD45RB低発現CD4陽性T細胞のみが、CD28分子と結合することが示された。このことから、メモリーCD4陽性T細胞上のB7-2分子は、T細胞上のCD28分子と結合しうると推測された。

　CD4陽性T細胞上のB7-2分子の副刺激活性を、ナイーブCD4陽性T細胞のIL-2産生を指標として検討した。分離したCD44低発現CD4陽性T細胞を固相化した抗CD3抗体(10ng〜1g/well)で活性化し、刺激後40時間並びに68時間のIL-2産生量を調べた。この際にパラホルムアルデヒドで固定したCD45RB低発現CD4陽性T細胞を共存させると、非共存下に比べ有意にIL-2の産生量が増加した。このIL-2の産生増強は抗CD3抗体量が30ng/well以上で、刺激後40時間後、68時間後でともに認められた。このCD45RB低発現CD4陽性T細胞によるIL-2の産生上昇は、添加するCD45RB低発現CD4陽性T細胞数に依存し、10³cell/cultureでほぼプラトーに達した。

　上述のIL-2産生増強に関与するCD45RB低発現T細胞上の効果分子を同定するため、抗B7-2抗体、抗B7-1抗体、コントロール抗体を0.1g/mlの濃度で培養中に加え、IL-2の産生増強に与える影響を調べた。その結果、CD45RB低発現T細胞共存下でみられたCD44低発現T細胞のIL-2産生増強は、抗B7-2抗体の添加によりほぼ完全に抑制され、抗B7-1抗体並びにコントロール抗体では抑制されなかった(図2)。

図2 メモリーCD4陽性T細胞によるナイーブCD4陽性T細胞のIL-2産生増強に与える抗B7-2抗体の影響分離したCD44低発現CD4陽性T細胞を固定したCD45RB低発現CD4陽性T細胞存在化に抗CD3抗体で刺激する際に、抗B7-2抗体を添加しIL-2産生に与える影響について検討した。

　これらの結果は、メモリーCD4陽性T細胞上のB7-2分子はナイーブCD4陽性T細胞のIL-2産生を効果的に増強し、副刺激分子として働くことを示している。

　分離したCD44低発現CD4陽性T細胞をT細胞除去脾臓細胞存在下に抗CD3抗体(5g/ml)で刺激したところ、CD44低発現CD4陽性T細胞上にB7-2の発現が誘導された。一方、B7-1の発現は認められなかった。さらにB7-2の発現は、T細胞除去脾臓細胞と抗CD3抗体がともに存在する時にのみ認められた(図3A)。この結果は、ナイーブCD4陽性T細胞上には、TCRからの刺激と抗原提示細胞上の分子を介する刺激で、B7-2の発現が誘導されると考えられる。このナイーブCD4陽性T細胞上のB7-2分子の発現誘導に関与する効果分子を同定するため、抗B7-2抗体(0.3g/ml)を添加すると、B7-2分子の発現は抑制され、一方コントロール抗体では影響されなかった(図3B)。これらの結果から、ナイーブCD4陽性T細胞上のB7-2分子の発現に関与する副刺激分子はB7-2であることが示唆された。

図3 T細胞除去脾臓細胞存在下に抗CD3抗体で刺激したナイーブCD4陽性T細胞上のB7-2分子の発現誘導(A)T細胞除去脾臓細胞存在下に抗CD3抗体でCD44低発現CD4陽性T細胞を刺激し、B7-2の発現をflow cytometryで解析した。(B)T細胞除去脾臓細胞と抗CD3抗体でCD44低発現CD4陽性T細胞を刺激する際にbiotin化抗B7-2抗体を添加し、B7-2分子の発現誘導に与える影響について検討した。

　さらに、CD44低発現CD4陽性T細胞を固定したB7-2CHO共存下に固相化した抗CD3抗体(1g/well)で刺激するとB7-2の発現が誘導され、抗B7-2抗体の添加により発現誘導が阻害された。また、抗CD3抗体と抗CD28抗体を用いてCD44低発現CD4陽性T細胞を刺激した場合も、B7-2分子の発現が誘導された。これらの結果からナイーブCD4陽性T細胞上のB7-2分子の発現は、TCRからの刺激とB7-2-CD28を介する副刺激を介して誘導されることが強く示唆された。しかしながら、本研究では、CD28からの副刺激が直接ナイーブCD4陽性T細胞上のB7-2分子の発現を誘導しているのか否かは明らかではない。

　以上より、1)マウスCD4陽性T細胞上にB7-1分子は発現しておらず、B7-2分子はCD4陽性T細胞の中でもメモリーCD4陽性T細胞上に強く発現していること、2)メモリーCD4陽性T細胞上のB7-2分子は有効な副刺激分子として働き、ナイーブCD4陽性T細胞のIL-2産生を増強しうること、3)一方ナイーブCD4陽性T細胞上のB7-2分子の発現誘導にはTCRからの刺激に加え、CD28を介する副刺激が必要であること、が示された。