Aspergillus niger由来-グルコシダーゼの高生産株の育種

　Aspergillus nigerの-グルコシダーゼは、オリゴ糖の生産のためにその大量生産株の作製が期待されている。また、-アミラーゼとグルコアミラーゼを用いてグルコースの生産を行う際には、-グルコシダーゼ欠損株が望まれている。これらの変異体を作製するために、すでに染色体遺伝子が4.3kbのSphI断片としてクローン化され、その塩基配列が部分的に決定されていた。

　このSphI断片ならびにその3’側660bpの全塩基配列を決定し、アミノ酸配列に翻訳して、既報のA.niger -グルコシダーゼの全アミノ酸配列(Kimura et al.Biosci.Biotech.Biochem.56,1368-1370,1992)と比較した。その結果、このSphI断片中に-グルコシダーゼの全アミノ酸をコードする配列が含まれていることが判明した。推定開始メチオニンからタンパク質のC末端までは3,121bp、アミノ酸残基数は985でイントロンは3つ存在した。推定開始メチオニンの5’側には、推定TATA box、CAAT boxが存在した。しかし、タンパク質のC末端の3’側には、典型的なpoly(A)付加シグナルは存在しなかった。

　この-グルコシダーゼ遺伝子をA.nigerに導入し、高生産株の作製を行った。-グルコシダーゼ遺伝子をもつプラスミドとハイグロマイシンB耐性遺伝子をもつプラスミドとをcotransformationでA.nigerに導入した。得られた形質転換体の-グルコシダーゼ活性を調べたところ、活性が3.5倍に上昇した株が得られた。欠損株の作製も行い、活性が1/3になった株を得た。

　ピラノースオキシダーゼは、グルコースの測定や糖尿病の診断用マーカーである1,5-アンヒドログルシトールの測定に用いられる。この酵素の大量生産を目的としてcDNAのクローニングを行い、大腸菌での発現を行った。

　C.versicolorの菌体から本酵素を精製し、部分アミノ酸配列を決定した。また、菌体からpoly(A)RNAを調製し、cDNAを合成してライブラリーを作製した。アミノ酸配列をもとに作製したオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングをして陽性クローンを得、塩基配列を決定して、本酵素の遺伝子構造を明らかにした。cDNAは1,869bpのオープンリーディングフレームを持ち、623アミノ酸をコードしていた。精製酵素のN末端は開始メチオニンから39番目のLysであり、38番目のLysまではプロテアーゼによって切断されてしまうものと思われた。終始コドンからpoly(A)の間の領域にpoly(A)付加シグナルは認められなかった。

　得られたcDNAをlacUV5プロモーター下に連結し、プラスミドあるいはスリーパーベクターを用いて大腸菌で発現させた。誘導後、37℃で培養した場合はインクルージョンボディーを形成したが、25℃で培養すると可溶性で発現した。得られた酵素の性質をしらべたところ、C.versicolorから精製したものとほとんど変わらなかった。スリーパーベクターで発現させ、培養条件の最適化を行い、21U/mlの高生産を達成した。

　クローン化したピラノースオキシダーゼのcDNAにランダム変異を導入することにより、酵素の耐熱性の向上およびKm値の低下を試みた。

　E.coli XL1-Redを用いて、本酵素を発現するプラスミドにランダム変異を導入した。この変異の入ったプラスミドを保持する形質転換体について、プレートアッセイおよび粗酵素抽出液を用いた活性測定によってスクリーニングを行い、耐熱性およびKm値に優れた変異株を取得した。変異部位を解析した結果、542番目のGluがLysに置換されていた。この変異酵素を精製し、野生型の酵素と性質を比較した。耐熱性は5℃上昇し、アルカリ側でのpH安定性も向上していた。至適pHはほとんど変わらなかった。グルコースに対するKm値は0.74mM(野生型は1.3mM)、1,5-アンヒドログルシトールに対するKm値は14.8mM(野生型は35.3mM)であった。

　ビリルビンオキシダーゼ(BOX)は肝機能の診断に用いられる。また、BOXは血清中のビリルビン以外の被検体を分析する場合に、測定値の誤差原因となるビリルビンを除去するのにも有用である。この酵素の大量生産を目的としてcDNAのクローニングを行った。

　信州ヒラタケ由来BOXを精製し、部分アミノ酸配列を決定した。データーベースでホモロジー検索を行ったところ、P.ostreatus strain Florida(フロリダヒラタケ)のpox2遺伝子産物(ラッカーゼ)およびpox1遺伝子から推定されるアミノ酸配列(タンパク質は確認されていない)と非常に高い相同性を示した。フロリダヒラタケのpox1遺伝子およびpox2遺伝子の塩基配列をもとに合成したプライマーを用い、染色体遺伝子を鋳型としてPCRを行い、信州ヒラタケのpox1遺伝子およびpox2遺伝子をクローニングした。それらの推定アミノ酸配列と精製酵素から決定したアミノ酸配列とを比較することにより、BOXはpox2遺伝子産物であることが明らかになった。BOXのラッカーゼ活性を調べたところ、活性が確認され、本酵素はすでに報告されているラッカーゼと同一酵素であることが判明した。

　トータルRNAを調製し、先に合成したプライマーを用いてBOXのcDNAをクローニングした。大腸菌での発現を試みたがうまく行かなかったので、A.sojaeでの発現を検討した。BOXのcDNAを有するプラスミドとniaDを有するプラスミドとを、プロテアーゼ欠損株であるA.sojae1860(niaD^-)にcotransformationで導入した。ラッカーゼ活性を検出できるアッセイプレートに形質転換体を植えつぎ、ラッカーゼを生産している株をスクリーニングした。プレート上で高活性を示した株についてシングルコロニー分離を行い、得られた1株を液体培養してBOX活性を測定したところ、0.6U/mlの活性が確認された。