in vivoでGPFXの肝取り込みを静脈内投与後の初期の血中濃度履歴と肝取り込み量をもとに速度論的に解析したところ、その取り込みクリアランスはほぼ血流速度に近い値を示し、効率よい取り込み過程の存在が示された。

　肝取り込み機構を調べるためにラット遊離肝細胞を用いて検討を行った。GPFXの取り込みはNa⁺イオンに非依存性の輸送であり、飽和性のあるcomponent(K_m173M,V_max6.96nmol/min/mg)と非飽和性のdiffusionから成り立っていた(図1-a)。また取り込みは代謝阻害剤の前処理によって低下することから、GPFXの肝臓への取り込みには一部carrier-mediatedな能動輸送の関与することが示唆された。LFLXはGPFXに対して競合阻害することが見い出され(図1-a)、LFLXの取り込みにも飽和性が示され、そのK_m値は436Mであった(図1-b)。GPFXの取り込みに対するLFLXのK_i値は480Mであり、LFLX自身のK_m値と同程度であることから、両薬物が同一の輸送系を介して肝臓に取り込まれることが推察された。

図1 Eadie-Hofstee plot of GPFXuptake(a)by isolated rat hepatocytes in the absence(●)and presence(○)of LFLX(1mM)and Eadie-Hofstee plot of LFLX uptake(b).

　また他のキノロン薬もGPFXの取り込みを阻害したが、GPFX自身による阻害が最も強く、輸送系への親和性が高いことが示された。

　ニューキノロンと称されるキノロン薬は生理的pHでイオン化したカルボキシル基及び塩基性アミンを有し、zwitterタイプの薬物である。そこで、GPFXの取り込みにおける種々の肝取り込み輸送系の関与の可能性を検討した。抱合型胆汁酸や有機アニオンであるpravastatin、有機カチオンであるcimetidine及び中性ステロイドのouabainのいずれの薬物の肝細胞への取り込みをもGPFXは濃度依存的に阻害した。しかしながら、GPFXの取り込みはこれらの化合物によって阻害を受けなかった。またGPFXの取り込みはquinidine等のamphipathicな有機カチオンによって阻害されることが示されたが、quinidineの取り込みに対するGPFXの阻害は小さく、quinidineの輸送系とも異なることが示された。以上の結果より、キノロン系化合物の肝取り込みにはcarrier-mediatedな能動輸送系が関与し、この輸送系は胆汁酸輸送系や有機アニオン、有機カチオン及びouabainの輸送系とも異なることが示された。

　GPFXの胆汁への排泄機構を検討する目的で、胆管側膜上で抱合代謝物や有機アニオンの胆汁排泄を担っているcanalicular multispecific organic anion transporter(cMOAT)を遺伝的に欠損したEisai-hyperbilirubinemic rat(EHBR)にGPFXを投与し、その胆汁排泄プロファイルを正常ラットと比較した。EHBRでのGPFXの胆汁排泄は正常ラットの約35%であった。またGPFXの主代謝物である3位グルクロン酸抱合体(GPFX-Glu)の胆汁排泄はEHBRでほとんど検出されなかった。したがって、これらの胆汁排泄にEHBRで欠損している輸送系が関与し、またその寄与する割合はGPFX-Gluでは親化合物に比較して大きいことが推察された。

　GPFXの胆汁排泄の輸送機構を解析する目的で、CMVへの取り込みを検討したところ、GPFXの取り込みにATP-依存性が認められた(図2-a)。この取り込みはEHBRから調製したCMVでは消失していた(図2-b)。したがって、in vivo試験のEHBRでの胆汁排泄の低下の結果を考え合わせると、GPFXの胆汁排泄の少なくとも一部はcMOAT関与の一次性能動輸送であることが示された。

図2 Uptake profiles of GPFX with(●)or without(○)5mM ATP by canalicular membrane vesicles prepared from normal rats(a)and EHBR(b).^*:P<.05,^**:P<.01(significantly different from the uptake in the corresponding ATP(-)group using Student’s t-test.)

　さらに輸送系への親和性をキノロン系化合物間で比較する目的で、cMOATの基質であるglutathione抱合体DNP-SGのCMVへの取り込みに対する阻害試験を行ったところ、いずれのキノロン系化合物も濃度依存的にDNP-SGのATP-依存性の輸送を低下させたが、GPFXが最も強い阻害を示した。したがって、キノロン系化合物のcMOATへの親和性は胆汁排泄クリアランスの大きさと相関することが推察できる。一方、GPFX-GluのCMVへの取り込みも顕著なATP-依存性が確認され、そのATP-依存性の輸送はEHBRのCMVでは著しく減少した。さらにDNP-SGのCMVへの取り込みに対するK_i値もGPFX-Glu自身の取り込みのK_m2値と一致したことから、GPFX-Gluの胆汁排泄の大部分にcMOATが関与していることが示された。

　GPFXはその構造中に不斉炭素を有することから光学異性体が存在する。この光学異性体の動態の差を検討する目的で定常状態kineticsを行った。親化合物の血漿中濃度及び胆汁排泄に差は認められなかったが、R(+)-GPFXのグルクロン酸抱合体(R-GPFX-Glu)の胆汁排泄はS(-)-GPFXのグルクロン酸抱合体(S-GPFX-Glu)の胆汁排泄より大きく、肝臓中濃度基準の胆汁排泄クリアランスにも同様な差が認められた。

　GPFXの立体異性体の輸送を遊離肝細胞及びCMVを用いてを比較したところ、遊離肝細胞への取り込み並びにDNP-SGのCMVへの取り込みに対する阻害効果には立体異性体間での差は認められなかった。一方で、R-GPFX-GluのCMVへの取り込みはS-GPFX-Gluのそれよりも約2倍大きく、胆汁排泄の違いは胆管側膜を介した排泄の差によることが示された。R-及びS-GPFX-GluのCMVへの取り込みのK_m値はそれぞれ17.3及び10.1Mであった(図3)。これらのK_mはDNP-SGの取り込みに対するそれぞれのK_i値と近似していることから、両抱合体の胆管側膜を介する輸送は同一輸送系をshareしていることが示された。これらの結果はcMOATがグルクロン酸抱合体の立体異性体を識別し、立体選択的な肝胆系移行を誘因するメカニズムの一つになることを提示している。一方、EHBRから調製したCMVにもATP-依存性の取り込みが残存し、胆汁排泄の多様性が示されたが、その輸送には立体選択性は認められなかった。

図3 Eadie-Hofstee plots for R-GPFX-Glu(○)and S-GPFX-Glu(●)uptake by CMV prepared from normal rats.

　GPFX及びLFLXのラットにおける肝胆系移行を比較した。Integration plotから求めた肝取り込みにおける膜透過性はGPFXの方が大きく、GPFXとLFLXの遊離肝細胞への取り込みの違いもこの結果を支持した。GPFX及びLFLXを静脈内定速投与し、定常状態時の両薬物の血液-組織間非結合型薬物濃度比K_pu2はそれぞれ1.7及び0.7であり、GPFXのより濃縮的な肝取り込みが示された。また、胆汁-肝臓中遊離型薬物濃度比はそれぞれ約6及び3であり、肝臓内遊離型薬物濃度基準の胆汁排泄クリアランスはGPFXの方が1.8倍大きい値を示し、胆管側膜を介した輸送能力もGPFXの方が高いことが実証された。

　本研究ではキノロン系抗生物質の胆汁排泄型、腎排泄型の違いを決める要因を明らかにする目的でキノロン系化合物の肝胆系移行性を評価した結果、肝取り込み過程と胆汁排泄過程の一部に輸送担体の関与することが遊離肝細胞やベシクルを用いたin vitro試験により明らかとなった。また、それぞれの過程の固有能力の違いが、キノロン系化合物の胆汁排泄クリアランスの大きさを決める要因の少なくとも一部であることが示された。