p27の発現量はユピキチン-プロテアソーム系によって負の制御を受けているという報告がなされていた(Pagano,M.et al.)。しかしユビキチン化p27の検出は再現が非常に困難であった。我々は独自の方法でin vitroおよびin vivoにおけるユビキチン化p27の検出を試み、p27が実際にユビキチン化を受けることを証明した。

　ユビキチン化p27を検出するために、リコンビナントp27をマウス細胞株の細胞抽出液と共にATP再構成系中でインキュベートし、反応物を抗p27抗体を用いたウェスタンブロッティング(免疫ブロット法)により解析した。効果的にp27のユビキチン化を検出するには、プロテアソームの除去、充分量のユビキチンの供給、ユビキチンアルデハイド添加によるアイソペプチダーゼ活性の抑制が鍵となった。細胞抽出液は、100,000xg、4時間の超遠心処理をしてプロテアソームを沈殿させた後の上清分画を用いた(S100Pr-)。アイソペプチダーゼは、26Sプロテアソームと結合しマルチユビキチン鎖を加水分解する酵素であるが、アイソペプチダーゼインヒビターであるユビキチンアルデハイドを反応系に添加すると、ユビキチン化p27の検出が劇的に上昇した。ユビキチンの反応系への大量添加もユビキチン化p27の形成を増加させた。また、ユビキチン(8kDa)の代わりにGST-ユビキチン(34kDa)を反応系に添加すると、バンドが高分子側にシフトしたことより、p27より高分子量のバンドはユビキチン化p27であることが確認された。さらにこれらの高分子量のバンドがユビキチン化p27であることを証明するために、免疫沈降法による解析を行った。ユビキチンの代わりにビオチン化ユビキチンを用いてユビキチン化反応を行い、反応産物を抗p27抗体で免疫沈降し、アビジン・パーオキシダーゼ複合体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、モノユビキチン化p27、マルチユビキチン化p27が検出された。

　さらにin vivoにおけるp27のユビキチン化の検出を試みた。プロテアソーム及びカルパインのインヒビター(阻害薬)、ALLN存在下でNIH3T3細胞株を培養し、その細胞抽出液を抗p27抗体を用いたウェスタンブロッティングで解析したところ、ユビキチン化p27が検出された。また、COS7細胞株にp27とユビキチンを一過性に共発現させると、ユビキチン化p27が検出された。さらにプロテアソーム特異的なインヒビターであるラクタシスチン存在下ではユビキチン化p27が増加した。

　p27はG0/G1期に蓄積し、S期への進行に伴って減少する。このp27の減少がユビキチン化によるのものか調べた。NIH3T3細胞株を接触阻害によってG0/G1期に同調させた後、S、G2/M期へと進行(リリース)させて経時的に細胞を集め、細胞周期、p27量、p27のユビキチン化活性を解析した。FACSによる細胞周期の解析の結果、接触阻害によってほぼ全ての細胞がG0/G1期に同調し、リリースの約12時間後に同調的にS期へ進行し、約21時間後にM期へ移行した。p27の発現量はG0/G1期に高く、G1/S移行期の9時間から12時間の間に急激に減少し、21時間後には最低となった。G0/G1期、G1/S期、G2/M期の細胞抽出液を用いてp27のユビキチン化活性を解析したところ、G1/S期において最も高活性を示した。これらの結果より、p27のユビキチン化活性は細胞周期依存的に変動していて、p27の発現量を制御していることが示唆された。

　p27のユビキチン化部位を同定するために、13箇所あるp27のリジン残基をアルギニン残基に置換した変異体、KR変異体を作成した。変異体p27を用いてin vitroユビキチン化反応を行い、抗p27抗体(TDL)を用いたウェスタンブロッティングで解析したところ、134番、153番、165番のリジンに変異を導入したKR5において、ユビキチン化活性が顕著に低下した。抗p27抗体(TDL)はp27の60番付近のアミノ酸配列を認識するため、59番のリジンに変異が導入されているKR1は抗p27抗体(TDL)では検出できなかった。そこでKR1に関しては別の抗p27抗体(C-19)を用いて解析したところ、野生型p27と同等のユビキチン化活性を示した。さらに野生型p27とKR5のユビキチン化反応を経時的に行ったところ、野生型と比較してKR5はユビキチン化活性が顕著に低下していた。よってこの134番、153番、165番のリジンのいずれか、または全てにユビキチンが付加していると考えられた。

　p27の分解について解析を進める中で、in vitro、in vivoの両方でp27のユビキチン依存的な分解と共に、27kDaが22kDa(p2722k)になるプロセシング(切断)活性が存在することに気付いた。in vitroで検出される急速なプロセシング活性がin vivoで検出されるプロセシング活性を再現しているか調べたところ、その分解産物の分子量が一致することが確認された。この反応はATP再構成系中で促進され、ATPの再構成を阻害するATP-Sによって抑制されることから、ATP依存的な反応であることが示唆された。またプロテアソームインヒビターであるクラストラクタシスチン--ラクトン、ZLLLalによって抑制されたので、プロテアソームの関与が示唆された。さらに様々なプロテアーゼインヒビターを用いてプロセシングエンザイムの予測を試みた。プロセシング反応はキモスタチン、PMSFで抑制され、アンチパイン、ペプスタチン、ロイペプチン、E64では影響を受けなかった。また、カスパーゼ-1インヒピター、YVADも、カスパーゼ-3インヒビター、DEVDもp27のプロセシングには影響を示さなかった。以上の結果より、このプロセシング反応はプロテアソームがもっているキモトリプシン様プロテアーゼによるものと予想された。

　尚、in vitro、in vivo両方において、カルパインインヒビターによってp2722kの蓄積が見られたことから、22kDa以下の分解はカルパイン様プロテアーゼによると推測された。

　p27の急速なプロセシング活性がp27の機能に影響するのか調べるために、まずプロセシング部位を推測した。p27のC末端にmyc-tagのついたp27のプロセシング産物、myc-p2722kが抗myc抗体で検出できることから、p27のN末端側がプロセシングされることが予測されていた。抗原性の異なる3つの抗体を用いて、p2722kを検出した。N-20、TDL、C-19の抗体は各々p27のアミノ酸2-21、60付近、181-198を認識することと、p2722kはN-20では検出されず、TDL、C-19では検出されることから、ゲル泳動度と鑑み、アミノ酸35〜40でプロセシングされると考えられた。そこでリコンビナントp2722kを作成し、in vitroにおけるサイクリンE/CDK2阻害活性を調べた。p2722kは野生型p27と比較して、CDK阻害活性が約1/100に低下していることがわかった。

　p27のプロセシング活性の変動が細胞周期の進行と相関しているのか調べるために、NIH3T3細胞株におけるin vivoプロセシング活性を解析した。p27の分解活性も、p27のプロセシング活性も、共にG0/G1期よりS期の方が高かった。p2722kのCDK阻害活性が低いことと、S期にプロセシング活性が亢進していることから、G1/S移行にはp27のプロセシングによる機能消失も大きな役割を果たしていることが示唆された。さらに、このプロセシングがユビキチン依存的か調べるために、野生型p27とKR5変異体(ユビキチン化を受けない)をNIH3T3細胞株に一過性に発現させたところ、共にp2722kが同程度検出された。よってこのプロセシングはユビキチン非依存的な反応であることが示唆された。以上の結果から、p27は2種類の機構により速やかに不活性化、及び除去され、CDK活性を上昇させて、細胞周期を進行させると考えられた