本研究では独自に確立した関節内癒着モデルを用いて実験を行った。関節内骨折に関する臨床的な知見をもとに、成熟家兎の大腿骨顆部両側の骨皮質の10×5mmの範囲を深さ3mmにわたって削切して海綿骨を露出させ、術後4週間にわたって膝関節を最大屈曲位で固定するという方法によって、外傷性の関節内癒着を近似するモデルを作製した。

TGF-1の活性抑制

　本研究では内因性のTGF-1の活性を阻害する方法として中和活性を有するモノクローナル抗体をリン酸緩衝生理食塩水(以下PBS)溶液として局所的に投与した。実際の投与には浸透圧を利用した体内埋込み式の小型ポンプ(Alzet 2ML4、Alza、Palo Alto、California、U.S.A.、以下浸透圧ポンプ)を用いた。このポンプは内部に蓄えた薬液を、生体内に埋め込んだ直後から4週間にわたって一定の流量で持続的に供給することができる。実験では1羽当たり2個のポンプを家兎の腹部皮下に埋入し、抗体溶液はこの浸透圧ポンプにそれぞれ接続した2本のポリエチレン製チューブを通じて大腿骨顆部内側および外側の骨皮質開窓部周囲に供給されるようにした。抗体溶液の濃度は予備実験の結果から、40、200、500g/mlの3通りに設定し、これらの群をそれぞれ低濃度抗体群、中濃度抗体群、高濃度抗体群と定義した(表1)。

　本研究では癒着の評価を肉眼所見、組織所見、力学的評価および癒着組織のコラーゲンに関する生化学的分析によって行った。

　肉眼所見では骨皮質開窓部周囲に形成された癒着組織を0から4までの評価点を与えることによって半定量的に評価した。

　組織所見では骨皮質開窓部に形成された癒着組織について光学顕微鏡によりヘマトキシリン・エオジン染色による組織像を検討した。

　力学的評価では癒着の形成にともなう伸展制限の程度を検討することとし、膝関節に一定の伸展トルクを加えて伸展させた際の膝関節の角度を術前と4週間の固定後に計測した。この2回の計測値の差を拘縮角と定義し、癒着の程度はこの値によって評価した。角度の実際の計測は、伸展トルクを加えた状態で膝関節側面のレントゲン写真を撮影して、このレントゲン上で行った。

　生化学的分析ではhydroxyprolineの定量による総コラーゲン含有量の定量とCNBr peptideの分析によるI型およびIII型コラーゲンの比率を検討した。

　骨皮質開窓以外の操作による癒着の形成と癒着以外の要因による関節の伸展制限を評価するため、骨皮質開窓の操作のみを行わずにこれ以外の手術操作と術後固定は抗体群と同様に行った群を非開窓群として設定し、また溶液投与による影響を評価するために、すべての手術操作と術後固定を抗体群と同様に行ったが浸透圧ポンプ内に溶液を全く注入しなかった群を非投与群として設定した。さらに、抗体投与に伴う中和活性以外の影響を評価するために、500g/mlの濃度の非特異的マウスIgG1・PBS溶解液を投与した群を非中和活性群として設定した。

　本実験には合計60羽の成熟日本白色雄性家兎を用いた。これらを無作為に10羽ずつの6群に分け、3群を抗体群とし、残る3群を対照群とした。各群において無作為に選んだ4羽を肉眼的評価および組織学的評価に用い、残る6羽を力学的評価および生化学的分析に用いた。各群に属する家兎が死亡などの理由で評価から除外された場合には、肉眼および組織学的評価に用いる家兎の数を減じることで対応することとした。

　得られたデータは、一元配置分散分析によって有意性の検定を行い、群間に有意の差があると判断された場合には、さらにDunnettの多重比較法を用いて事後検定を行った。有意水準は5%に設定した。

　非開窓群では癒着組織の形成がほとんど観察されなかったのに対し、非投与群、非中和活性群ではともに骨皮質開窓部周囲に密な線維性組織の形成が観察された。低濃度抗体群の線維性癒着組織の形成は非投与群とほぼ同等であったが、中濃度抗体群および高濃度抗体群では癒着の形成量が少なく、また生じた組織は柔らかであった。

　非投与群と非中和活性群の癒着組織はともに未成熟な線維芽細胞を含む線維性組織であった。低濃度抗体群の癒着組織は非投与群、非中和活性群と同様であった。一方、中濃度抗体群および高濃度抗体群の癒着組織は、骨皮質開窓部の底部では他の群と同様の密な線雄性組織であったが、表面に近い部分では比較的疎な組織となる傾向があった。非開窓群は癒着組織の形成がわずかであったため、組織学的評価から除外した。

　非開窓群の拘縮角は平均2.1度であったのに対し、非投与群と非中和活性群の拘縮角はそれぞれ平均67.1度、63.8度であった。3つの抗体群では拘縮角は抗体投与量に依存して減少した。3群の拘縮角はいずれも非投与群より有意に小さく(低濃度抗体群、p<0.05;中濃度抗体群および高濃度抗体群、p<0.01)、とくに中濃度抗体群と高濃度抗体群の拘縮角は、癒着組織の形成がほとんどなかった非開窓群のデータと有意差がないまでに減少していた(図1)。

図表表1.実験群の構成 / 図1.各群の拘縮角 グラフは平均値および標準偏差を表す。 *:非投与群に対してp<0.05 **:非投与群に対してp<0.01

　非投与群および非中和活性群の癒着組織はほぼ同量の総コラーゲンを含有し、I型およびIII型コラーゲンの比率にも大きな差はなかった。一方抗体群では総コラーゲン含有量が投与量依存的に減少し、3群をはいずれも非投与群より有意に総コラーゲン含有量が少なかった(低濃度抗体群、p<0.05;中濃度抗体群および高濃度抗体群、ともにp<0.01)。一方、癒着組織中のIII型コラーゲンの比率は抗体投与により投与量依存性に増加する傾向を示し、中濃度抗体群および高濃度抗体群の比率は非投与群より有意に高値であった(ともにp<0.05)。非開窓群は癒着組織の形成量が少なかったため、生化学的評価から除外した。