植物へ導入された外来遺伝子はメンデルの法則により後代へ遺伝することは知られているが、宿主のゲノムへの組み込みパターンと後代への遺伝についての詳細な研究はなされていない。遺伝子組換えを利用した育種をする場合には、これらの知見は必須であると考え、研究をおこなった。

　エレクトロポーレーション法によりハイグロマイシン(hph)耐性遺伝子とグルクロニターゼ(GUS)遺伝子を別々のベクターを介して同時にイネへ導入した。得られた12系統の形質転換体と非形質転換体の当代から3代目までのゲノムDNAを抽出し、プローブと制限酵素の18の組み合わせでサザンブロット分析した。同時に、ハイグロマイシン耐性について分離比検定を行った。

　その結果、ゲノムへは完全なhphの他に機能しないDNAフラグメントが組込まれることがわかった。ただし、プラスミドが切断される場所は個体により異なっていた。また、遺伝子の発現が強い場合にはメンデルの法則による遺伝を示したが、発現が弱い系統では、はっきりしたメンデル遺伝が見られない場合があった。さらに、GUSとhphは同じローカスに組込まれるため、後代において両者が分離しない場合と、別のローカスに組込まれることにより、両者を分離できる場合が観察された。以上のことから、外来遺伝子は宿主ゲノムに組込まれ、数世代にわたり安定してメンデルの遺伝法則に従うことが分かった。

　本研究の根本の命題であるフェリチン遺伝子による鉄の蓄積が起こり得るのか、また、蓄積する場合において遺伝子発現と鉄含有量の関係がどのようになっているかを実験植物であるタバコを用いて検討した。

　アグロバクテリウム法によりタバコへフェリチン遺伝子を導入した。フェリチン遺伝子はカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターで制御されている。形質転換体の葉からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法によりフェリチンの発現量と修飾について解析するとともに、鉄の含有量を測定した。

　その結果、個体により差はあるもののフェリチンは発現されており、葉緑体への輸送シグナルであるトランジット・ペプチド(TP)が切断され成熟型のサブユニットになることが確かめられた。そして、各個体の鉄含有量とフェリチンの発現量との間に、相関関係(R＝0.87)が認められた。最も鉄含有量が多い個体の鉄含有量はコントロールの1.3倍であった。さらに、免疫組織的な観察によりフェリチンが植物体全体で発現していることが分かった。以上のことから、植物中の鉄含有量を増加させるためにはフェリチン遺伝子の利用が有効であるということが示された。

　前述のようにフェリチン遺伝子の有用性が認められたので、商品作物であるレタスを対象にして同様な実験を行った。この場合、鉄の蓄積以外の表現型が極端に母品種と異なると問題となるため、実際に栽培して、母品種であるコントロールと形質転換体の表現型を観察した。

　その結果、レタスでもタバコの場合と同様にフェリチンの発現と鉄の蓄積が認められた。コントロールと比較して形質転換体では、最大1.7倍の鉄含有量の増加があった。一方、他の重金属の動向を探るため、鉄と生体内での挙動が類似しているマンガンの含有量を測定したが、コントロール植物と差は認められなかった。次に成長量を調べるために、発芽時の幼植物体の生重量、播種後3ヶ月後の高さ、及び種子重量を指標にしてコントロールと比較した。その結果、形質転換体の方がコントロールより全ての指標で上回っていた。また、形質転換体の光合成速度はコントロールの1.5〜1.8倍になっていた。しかし、外見に関して奇形を呈することはなかった。以上のことから、フェリチン遺伝子導入作物は鉄のみを蓄積し、他の重金属を蓄積しないことが示唆された。また、外来フェリチン遺伝子の発現により、特に問題となるような表現型は出現せず、むしろ旺盛な生育を新たに付与できることが明らかとなった。

　フェリチン遺伝子が単子葉植物でも機能するか、また、フェリチンを組織特異的に発現させた場合に、鉄を蓄積できるかどうかをイネを用いて検討した。

　イネの種子貯蔵タンパク質グルテリンのプロモーター(GluB-1)で制御されるフェリチン遺伝子をアグロバクテリウム法でジャポニカ米に導入した。遺伝子の発現をmRNAレベルで解析するために逆転写PCR法を適用した。また、フェリチンの存在をウエスタンブロット法で確認するとともに免疫組織学的観察をおこなった。次に、米全体にに含まれる鉄分を測定した。また、組織毎(胚、胚乳、葉、茎、根)に鉄含有量を測定した。

　結果として、まず、フェリチンmRNAが形質転換体の種子にのみ存在することが分かった。また、タンパク質レベルでは、双子葉植物と同様にTPが切断された成熟型のサブユニットになることが確かめられた。さらに、フェリチンの胚乳への局在が、免疫組織染色により明らかになった。一方、形質転換体の米における鉄含有量はコントロールと比較して最大3倍程度となった。しかし、葉、茎、根においては両者の鉄含有量には差がなかった。米の中で鉄分は、フェリチンの分布と一致して胚ではなく胚乳に特異的に蓄積されていることが分かった。以上のことから、フェリチン遺伝子は単子葉植物でも機能すること、GluB-1プロモーターにより胚乳特異的に鉄を蓄積することが示された。

　以上の研究によって、フェリチン遺伝子を導入した植物では、鉄の含有量が増加し、その形質が安定して後代へ遺伝することが想定された。また、ダイズフェリチンは、形質転換した双子葉植物と単子葉植物の両方で差がなく、機能することがわかった。さらに、プロモーターを選択することで植物全体に、または、組織特異的にフェリチン遺伝子を発現させ、その組織にのみ、鉄を蓄積できることが示された。また、フェリチン遺伝子を恒常的に発現させると旺盛な生育を示すことがわかった。これらの知見は、外来フェリチン遺伝子を用いて、鉄含有量が高い作物の分子育種が可能なことを示しただけでなく、生長の早い植物を作出する可能性を明らかにしたと言える。