図1に本研究で製作したSPR、OWMの光学系の構成を示す。SPR、OWMは試料の作成方法に相異があるのみで、計測装置の構成は全く同じであるため、同一の装置で計測することができる。図2にSPR、OWM計測で使用するキュベット部分の構成図を示す。

図1 製作したSPM、OWMの光学系の構成

図2 SPM、OWM装置キュベット部の構成

　試料は、平行平面ガラス基板にクロムを10Å、さらに金を430Å重ねて真空蒸着し金属薄膜とした。SPRの構成では、この試料を金属薄膜を内面としてキュベットに装着した。OWMの構成では、金属薄膜にさらに重ねて10%ポリウレタン溶液をスピンコータで2mコーティングし、試料とした。

　タンパク溶液として、アルプミンーリン酸パッファ(PBS)溶液(4g/dl)、-グロブリン-PBS溶液(1.2g/dl)を使用した。金表面への-グロブリン吸着の計測では、キュベット内に満たされた生理食塩水を急速に-グロブリン溶液に置換したときの反射率の経時変化を計測した。引き続いて反射率がほぼ一定になったのちに、キュベット内の-グロブリン溶液を生理食塩水で洗浄した。同時に入射角-反射率プロファイルを-グロブリン溶液への置換前、置換後、生理食塩水洗浄後の3点で計測した。ポリウレタン表面へのアルブミン、-グロブリン吸着の計測でも、前記と同様にタンパク溶液で急速置換、生理食塩水洗浄を行い、反射率の経時変化、入射角-反射率プロファイルを計測した。同様の計測をヘパリン加全血についても行った。

　図3に材料表面に電界を形成するために製作したキュベットの構造を示す。ガラス基板に蒸着したクロム-金薄膜を一方の電極とし、さらにそれに対向する電極の間に電位を加える。溶液-蒸着膜間の電位は別に参照電極を設け計測した。このキュベットを用いて、直流電界下でのポリウレタン表面へのアルブミン吸着をOWMで計測した。

図3 材料表面に電界を形成する対向電極構造

　まず、電極間の電位を変化させたときのアルブミン吸着の変化を調べた。PBSで満たされた電極間に金薄膜側を正として0.6Vの電位を加え、PBSをアルブミン溶液で急速に置換する。6分の経過観察後、電極間の電圧を0Vとした。さらに、20分後に電極間の電圧を0.6Vに戻した。この間の反射率の経時変化、入射角-反射率プロファイルをOWMで計測した。次に、双方の電極間の初期電位を-1000mVから+1000mVまで変化させながら、OWMでアルブミン吸着量の変化を計測した。

　人工材料への血漿タンパク吸着を計測する手法としては,吸着前後の試料の微小重量変化を計る方法に始まり、Ellipsometry法、放射性同位元素抗原抗体法、金コロイド標識抗体法など数々の手法が試みられてきた。しかしそのいづれも吸着タンパクに何らかの処理を施したり、タンパク吸着面を露出して計測しなければならないなど、吸着反応を実時間で観察できなかった。このような理由で、吸着反応を実時間で計測できる手法としてSPR法が注目されるようになり、ポリスチレンへのアルブミン、-グロブリンの吸着をSPR法で計測した結果が最近報告されている。

　しかし、表面プラズモン共鳴法による計測は反応の前後におけるディップ位置の相対的変化として表され、何らかの別の手法で角度変化量を校正しなければ絶対量を計測できないという欠点がある。そこで本研究では、単独で吸着の絶対量が計測できる手法として新たにOWM法について検討を行った。

　SPR法とOWM法とを比較すると、計測装置の構成はほとんど同じであるが、以下のような相異がある。

　1)SPR法は表面プラズモン共鳴により金属薄膜表面近傍の変化を検出する。これに対し、OWM法は金属薄膜を透過したevanescent光の定在波により媒質界面の変化を検出する。

　2)SPR法で、吸着厚みを算出するには吸着物の屈折率を知る必要がある。OWMでは入射角-反射率プロファイルの解析のみで試料の屈折率と厚みが算出できる。

　3)計測に最適な高分子膜の膜厚はSPR法で30nm、OWM法で2mであり、OWM法では高分子膜試料の作成が容易である。

　4)OWM法ではSPR法に比べて小さい入射角で計測が可能であり、試料の照射範囲が狭くできる。

　5)OWM法ではSPR法に比べて計測すべき角度範囲が広く、測定精度が要求される。

　SPR法、OWM法はともに厚み方向はナノメータの分解能を持つが、面方向の分解能はこれに比べて劣る。面方向分解能はSPR法でほぼ10m、OWM法では通常の光学顕微鏡と同程度である。吸着物の不均一性がこの限界を超えるとき、入射角-反射率プロファイルの形状が理論値から外れてくる。これを利用して、計測した入射角-反射率プロファイルの形状を理論値と比較し、吸着の不均一性を評価した。

　本研究で計測した金、ポリウレタンへの-グロブリン、アルブミンの吸着速度は他の報告によるSPR法で計測された銀、ポリスチレンへの-グロブリン、アルブミンの吸着反応とほぼ同様な傾向を示した。また、金、ポリウレタンへの-グロブリン吸着厚みも銀、ポリスチレンへの-グロブリン吸着と同様に単層でほぼ全面に吸着していることが示唆された。一方、ポリスチレンへのアルブミン吸着は-グロブリンと同様に単層でほぼ全面に吸着するとされているが、本研究で得られたポリウレタンへのアルブミシの吸着は多層で不均一に吸着していることが示唆されている。このポリスチレンとポリウレタンでのアルブミン吸着の相違は、金コロイド標識抗体法による報告でも確認されている。

　全血でのポリウレタン表面への吸着反応では,-グロブリン、アルブミン、フィブリノゲンが混合して吸着することを放射性同位元素抗原抗体法、金コロイド標識抗体法で計測し、以前に報告した。従って、本実験でもこれらの血漿タンパクが混合して吸着していると思われるが、SPR法、OWM法では双方とも吸着タンパクの種類、組成を知ることはできない。吸着の立ち上がりの速さから-グロブリンが、洗浄による解離と吸着の不均一性からアルブミンが類推されるが、フイブリノゲンなどの未計測のタンパクが存在すること、タンパク間の相互作用が想定されることから、断定はできなかった。

　本研究では、電界下のポリウレタンへのアルブミン吸着は正極において抑制され、負極において促進されるという結果が得られたが、これは従来の知見と矛盾しているように思われた。従来の知見では、アルブミンは溶液中で負に帯電し、正極においてポリウレタンの溶液側表面には正の電荷が励起されると考えられる。さらに、白金、カーボンを電極としてアルブミンの電極への吸着を計測した実験では、アルブミンの吸着は陽極において促進されることが報告されている。そこでこの結果を説明する仮説として、溶液中の陰イオンとアルブミンとの競合吸着が考えられた。

　タンパクの高分子膜への吸着反応は、拡散過程が律速となる。そして、溶液中に含まれる塩素イオン、リン酸イオンなどの小さく質量の軽い陰イオンの方がアルブミンよりも移動度が高い。このためこれらの陰イオンがアルブミンよりも先に高分子表面に吸着され、アルブミンの吸着が阻害されると考えられた。なお、溶液中の陰イオンとアルブミンとの競合吸着については、カーボン電極で本実験と同様に正極での拡散過程での抑制が起こることが報告されている。以上、本実験の結果からポリウレタン表面へのアルブミンの吸着は、初期に直流電圧を印加することで制御できる可能性があることが示された。