アフラトキシン(aflatoxin)は、強力な発ガン性を有するカビ毒として知られ、Aspergillus属のAspergillus flavus,Aspergillus parasiticus,Aspergillus nomius等により生産される。aflatoxin生産菌はピーナッツ等の農作物に感染し、熱帯や亜熱帯の環境条件下でaflatoxinを生産し作物を汚染する。aflatoxinに汚染された作物の恒常的な摂取は肝臓癌を引き起こし、現在、アジアやアフリカ等のaflatoxin高汚染地帯では、年間25万人に上る人々がaflatoxinが原因の肝臓癌により死亡していると推定されていろ。従って、農産物をaflatoxin汚染から守ることは安全な食糧を確保する上で重要な課題の一つであり、防除のための有効な薬剤の開発が急がれてきた。

　aflatoxinの汚染を防除するには、第一に、生産者である真菌の生育を阻止する方法が考えられる。しかし、強力な抗真菌剤は植物や哺乳類に対する毒性も強いことが多く、又、その汎用による、これまで多くの抗生物質の使用で繰り返し見られてきた、早期の薬剤耐性菌の出現が懸念される。一方、aflatoxinは二次代謝産物として生産されることに注目すれば、その生合成を阻害しても生産菌の生育には影響を与えないと考えられる。従って、aflatoxinの生産は阻害するが生産菌の生育は阻害しないような物質が得られれば、高選択性の、耐性菌が出現しにくい薬剤となる可能性が高いと考えられる。

　そこで、著者はaflatoxin生産菌であるA.prasiticusとaflatoxin高感受性菌株のBacillus megateriumを用いるバイオアッセイ法を開発しaflatoxin生産阻害特質の検索を試みた。その結果、Streptomyces属と同定された一放線菌の代謝産物中に阻害活性を見いだし、活性物質の単離、構造解析を行ったところ新規化合物と分かり、aflastatin Aと命名した。

　本研究では、aflastatin Aの検索、生産菌の同定、aflastatin Aの単離、構造決定および、その類縁体であるaflastatin B、blasticidin Aの構造決定、並びにaflastatin Aの生合成、aflastatin類の生物活性について検討を行った。以下にその結果を要約する。

4.aflastatin A類およびblasticidin Aの構造決定

　aflastatin AおよびBは無色の粉末で、その分子式はHR-FABMSスペクトルおよび各種NMRスペクトルの解析より、各々、C⁶²H¹¹⁵O²⁴NおよびC⁶¹H¹¹³O²⁴Nと決定された。aflastatin類のUV吸収スペクトルはpH依存性であり、中性、塩基性溶液中では299および247nmに吸収極大を有し、酸性溶液中では314および237nmに極大がシフトした。又、IR吸収スペクトルには、3300-3400cm^-1に水酸基由来、1600cm^-1にカルポニル基または二重結合由来と思われる強い吸収が認められた。

　aflastatin Aの構造は、各種NMRスペクトルの解析およびaflastatin Aの過沃素酸酸化により生成したフラグメント分子の構造解析等により図1に示すものであることが明らかとなった。更に、aflastatin BについてもHR-FABMSおよび各種NMRスペクトルの解析により、これがaflastatin AのN-デメチル体であることが判明した(図1)。

　一方、blasticidin AはKono等¹⁾によって単離された放線菌由来の抗生物質であり、その理化学的性質が、上記の単離・構造解析の過程で判明したaflastatin Aのものと類以していた。そこで、blasticidin Aのaflatoxin生産阻害活性を調べたところaflastatin Aと同様の活性を有していることが判明した。よって、構造未決定であったblasticidin Aについてもaflastatin Aと同様の手法によりその構造を明らかにした(図1)。

図1.aflastatin類の構造

　aflastatin類およびblasticidin Aの構造はtetramic acid骨格を有する直鎖状ポリオールという特異なものであった。

5.aflastatin Aの生合成

　aflastatin Aは直鎖状ポリオール構造を有することから、ポリケタイド経路により生合成されることが予想された。しかし、その水酸基の一部は通常のポリケタイド経路からは生成が予測されないものであった。そこで、aflastatin Aの生合成を解明するため、¹³Cでラベルした酢酸、ブロピオン酸、グルコース、グリコール酸の取り込み実験を行い、その生合成が図2に示すものであることを明らかにした。特に、aflastatin Aには2分子のグリコール酸が連続して取り込まれ、その生合成は特異なものであった。

図2.aflastatin Aの生合成

　アフラトキシン(aflatoxin)は数種のAspergillus属のカビが生産する強力な発癌性を有する毒性化合物である。熱帯,亜熱帯地域では,これら生産菌がピーナツなどの農作物に感染することによってアフラトキシンに汚染され.そのような作物を摂取すると肝臓癌が引き起こされることがわかっている。本研究はアフラトキシン生産菌の生育を阻害することなく.アフラトキシンの生産のみを特異的に阻害する化合物を見い出し.その構造解析と生物活性を述べたもので,緒言のはか3章がらなる.

　緒言では,ポリケチド生合成経路を経て二次代謝物として合成されるアフラトキシンの汚染は世界的に食品衛生上極めて重大な問題であり,その対策を急ぐ必要があるが,これまでそれに対する有効な対策は見つかっていないことを述べている。

　第1章では,アフラトキシン生産を特異的に阻害する化合物を検索する方法を確立し,それを用いて土壌から分離した放線菌をスクリーニングした結果,目的の活性を有する化合物を生産する菌株を得たことを述べている。すなわち,アフラトキシン生産菌Aspergillus parasiticus NRRL2999株に対して放線菌の培養ろ液を供し,まず生育を阻害するものを除外し,生育には影響を及ぼさなかったもののなかから,アフラトキシン生産を阻害するものを選択した。この際,アフラトキシン生産量は,アフラトキシン感受性であるBacillus megaterium ATCC25848株を用いたペーパーディスク法による簡便な方法によって測定した.このスクリーニング法により,神奈川県逗子市の土壌がら分離された一放線菌の培養ろ液に目的の活性を認めた。

　第2章では,その放線菌の同定および活性物質の精製,構造解析,生合成と生物活性について述べている。活性物質の生産菌は形態,生理的性質,炭素源の資化性,細胞壁構成成分の分析等からStreptomyces sp.MR1142と同定した。MR1142株の培養条件を検討した後.培養菌体からメタノール抽出し.抽出液を溶媒分画.溶媒沈殿により粗精製した後,塩基性条件下で逆相HPLCにより2種類の活性物質を単離し,aflastatin AおよびBと命名した。それぞれの収量は培養液1リットルあたりそれぞれ125mg, 1.3mgであった。まず,主要成分であるaflastatin Aについて構造解析を行った。種々の機器分析データから分子式はC⁶²H¹¹⁵O²⁴Nと決定された。各種NMR解析から部分構造が推定され,過沃素酸酸化によって得られた分解物の構造解析と総合することにより,図1に示す構造であると決定した。すなわち,一端にはテトラミン酸骨格を,中央部に水酸基を多数もつ鎖状構造を,他端にはアルキル鎖を有する特異な構造であった。また,aflastatin Bの構造はaflastatin Aの分析データとの比較からaflastatin AのN-デメチル体であることがわかった。aflastatin Aはラベルした酢酸,プロビオン酸,グルコースおよびグリコール酸の取り込み実験の結果から.図2に示す様式で生合成されることがわかった。

図1.aflastatin Aおよびblasticidin Aの構造

図2.aflastatin Aの生合成

　aflastatin Aはアフラトキシン生産菌であるA.parasiticus NRRL2999株に対して濃度依存的にアフラトキシン生産を阻害し,0.5g/mlの濃度で完全に阻害したが,その濃度で菌体重量はaflastatin Aを添加しない対照と有意な差は認められなかった。

　第3章では,1968年,KonoらによりStreptomyces griseochromogenesの培養菌体からイモチ病菌に対して強力な抗菌活性を有する化合物として単離されていたblasticidin Aの埋化学的性状がaflastatin類に類似しており,またそれがaflastatin Aと同様にアフラトキシン生産阻害活性を示すことが明らかなり.未だその構造が決定されていなかったことから,本化合物を単離し,構造を決定した。その結果,blasticidin Aはaflastatin類ときわめて類似の構造を有することがわかった(図1)。blasticidin Aのアフラトキシン生産阻害活性はaflastatin類と同程度であった。

　以上,本論文はアフラトキシン生産菌の生育を阻害することなく,その二次代謝産物であるアフラトキシンの生産を特異的に阻害する物質のスクリーニング法を開発し,その方法を用いて特異な構造を有する新規化合物を得たものであり,学術上,応用上貢献するところが少なくない。よって,審査員一同は.本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。