Philadelphia染色体(Ph¹染色体)は慢性骨髄性白血病(CML)の95%、急性リンパ球性白血病(ALL)の10-20%に認められる転座型染色体異常である。これは9番と22番染色体の相互転座t(9;22)(q34;q11)により生じ、この結果9番染色体のc-abl遺伝子と22番染色体のbcr遺伝子、との融合遺伝子BCR/ABLが産生されることが疾患の原因と考えられている。融合部位の違いにより、210Kdの融合遺伝子産物p210^bcr/ablと190Kdの融合遺伝子産物p190^bcr/ablが産生されるが、p210^bcr/ablはCMLのほぼ全例およびPh¹染色体陽性ALLの半数で認められ、p190^bcr/ablはPh¹染色体陽性ALLの残りの半数で認められる。p210^bcr/ablおよびp190^bcr/ablはいずれも正常のc-abl遺伝子産物に比べて高いチロシンキナーゼ活性を持ち、この増強されたキナーゼ活性が疾患の発症に関わっていると考えられている。しかしこれらの融合遺伝子産物の発現が本当に白血病の原因遺伝子である事を確かめるためには、単離された遺伝子を生体内で発現させる事により疾患が再現出来るかどうかを検討する必要がある。この目的のために行われた主な実験はウイルスを用いた骨髄移植実験とトランスジェニックマウスの作製である。

　骨髄移植実験は主にp210^bcr/ablに関して行われた。1990年にDaleyらは5FU処理したマウス骨髄細胞にレトロウイルスを用いてp210^bcr/ablを感染させ、放射線照射をした同系マウスに移植する骨髄移植を行った。移植を受けたマウスはCML、ALLを含めた血液腫瘍を発症し、p210^bcr/ablが白血病の原因遺伝子である事が確がめられた。その後、様々なグループからp210^bcr/ablを発現するレトロウイルスを用いてマウスに同種骨髄移植実験が行われ、CML、ALL、悪性リンパ腫、赤白血病、マクロファージの腫瘍を含めた様々な血液悪性腫瘍が発症する事が明らかとなった。

　一方、トランスジェニックマウスもBCR/ABL融合遺伝子産物の生物学的作用を知る上で有用な方法である。Heisterkampらはメタロチオネインプロモーターを用いてp190^bcr/ablのトランスジェニックマウスを作製し白血病の発症を報告した。p190^bcr/ablは造血組織およびその他の臓器に発現が認められたが、トランスジェニックマウスはB細胞性白血病を発症し、p190^bcr/ablはALL発症に関与することが明らかとなった。p210^bcr/ablのトランスジェニックマウスに関しては、Hariharanらがc-ablの代わりにウイルス由来の遺伝子v-ablをbcrにつないだp210^bcr/v-ablを用いたトランスジェニックマウスを作製し悪性リンパ腫の発症の報告した。しかしp210^bcr/V-ablはp210^bcr/ablに比較するとbcrおよびc-ablに由来する部分を一部欠いており、またアミノ酸の変異も認められるため、この結果が本当にp210^bcr/ablの生物学的機能を直接反映しているかどうかについては疑問が残る。この問題を解決する目的で我々はメタロチオネインプロモーターを用いてp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスを作製した。得られた6匹のファウンダーマウスのうち2匹が生後約3カ月で急性白血病を発症した。肉眼的には胸腺、脾臓、リンパ節の腫大が見られ、病理学的な解析ではほとんど全ての臓器に白血病細胞の浸潤が認められた。生化学的な解析では白血病細胞の浸潤臓器にp210^bcr/ablの発現が認められ、また細胞内蛋白質のチロシンリン酸化の亢進も認められた。発現したp210^bcr/ablはチロシンリン酸化を受けており、強いキナーゼ活性を示した。表面抗原およびサザンブロットによる解析によりトランスジェニックマウスに発症した白血病はモノクローナルなT細胞性白血病であることが明らかとなった。白血病を発症した2匹のファウンダーマウスのうち1匹から子孫に安定にトランスジーンを伝えるラインが確立され、現在までにトランスジーンをもつマウスの約1/3に急性白血病の発症が観察されている。以上の結果は、p210^bcr/ablが急性リンパ球性白血病を発症しうる事をトランスジェニックマウスの系を用いて初めて示したものと言える。更に各ラインにおけるp210^bcr/ablの発現の解析結果から、p210^bcr/ablの生体内における造腫瘍性は造血組織特異的である事が判明した。この結果は、Ph¹染色体が造血器腫瘍に限って認められるという実際の臨床データにモデルマウスの面から根拠を与えるものである。

　この様に、トランスジェニックマウスはp210^bcr/ablの生物学的作用を解析する上で優れた手法である。しかし、骨髄移植実験ではCML、ALLを含めた様々な血液腫瘍が発症するのに対し、トランスジェニックマウスではリンパ球系腫瘍の発症しか認めらておらず、CMLのモデルマウスは現在まで作製されていない。この問題を解決するために、まず血液幹細胞レベルで目的遺伝子の発現を可能にする新たなプロモーターの単離を行った。tecは血液前駆細胞で高い発現を示す細胞質型チロシンキナーゼである。tecプロモーター約2kbを単離し、転写開始点を決定し、血液細胞株を用いてそのプロモーター活性を確認した。この2kbのプロモーターを用いてp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスを作製した。その結果、ファウンダーマウス2匹に生後約3カ月でALLの発症を認めたが、その子孫マウスに生後約1年経ってからCML様の病態の発症が認められた。CML様の病態を呈するマウスでは末梢白血球は成熟顆粒球で占められ、血小板増多および貧血も認められた。骨髄は著明な骨髄球系の細胞の過形成を呈し、腫大した脾臓およびリンパ節にも成熟顆粒球の浸潤が認められた。更に1匹のマウスでは肺に芽球の増殖を認め、髄外性の急性転化の可能性が示唆された。これらのトランスジェニックマウスに認められた結果は、p210^bcr/ablはCMLとALLという臨床的に異なる疾患の発症に寄与しうる事を強く示唆するものである。また、骨髄移植実験で報告された悪性リンパ腫、赤白血病、マクロファージの腫瘍の様に臨床的にPh¹染色体を認めない造血器腫瘍は発症しておらず、より正確に生体内におけるp210^bcr/ablの生物学的機能を反映していると考えられる。この我々が作製したp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスは、Ph¹染色体陽性白血病のモデルマウスとして病態の解析、急性転化機構の解明、治療医薬の開発等に役立つ事が期待される。

　Ph¹染色体は慢性骨髄性白血病(Chronic myelogenous leukemia:CML)および急性リンパ球性白血病(Acutelymphoblasticleukemia:ALL)で認められる染色体異常であり、融合遺伝子産物p210^bcr/ablが産生されることが疾患の原因であると考えられている。p210^bcr/ablの生体内における造腫瘍性を解析する目的では、マウス骨髄細胞を採取し、p210^bcr/ablを発現するレトロウイルスを感染させ、放射線照射をした同系マウスに移植する骨髄移植実験が主に行われており、移植を受けたマウスにCML、ALL、macrophage tumor、lymphoma、erythroleukemia、reticulumcellsarcomaを含めた様々な造血器腫瘍が発症する事が知られている。これに対し、本研究はトランスジェニックマウスの手法を用いてp210^bcr/ablの生物学的機能の解析を行うとともにPh¹染色体陽性白血病のモデルマウスの作製を行ったものであり、以下の結果を得ている。

　1・メタロチオネインプロモーターを用いてp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスを作製し、得られた6匹のファウンダーマウスのうち2匹およびその子孫のトランスジェニックマウスに再現性よく急性白血病の発症を認めた。白血病マウスでは末梢血に顆粒を持たないリンパ芽球様の細胞が増殖しており、胸腺、脾臓およびリンパ節の腫大も認め、ほとんど全ての臓器に白血病細胞の浸潤を認めた。白血病細胞の浸潤臓器にはp210^bcr/abl蛋白質の発現および細胞内蛋白質のチロシンリン酸化の亢進を認め、発現したp210^bcr/abl蛋白質は高いキナーゼ活性を示した。また、Flow cytometryを用いた表面抗原の解析では白血病細胞はThy1.2というT細胞系の抗原を高発現しており、さらにSouthem blotでT細胞受容体遺伝子に再構成を認めたことから、モノクローナルなT細胞性腫瘍であることが明らかとなった。以上の結果から、p210^bcr/ablはALLの原因遺伝子になりうることを証明し、p210^bcr/ablトランスジェニックマウスの作製に初めて成功した。

　2・白血病を発症するラインと発症しないラインが生じる原因を解析するため、子孫にトランスジーンを安定に伝える4ラインにおいてトランスジェニックマウスの各臓器におけるp210^bcr/ablmRNAの発現をRT-PCR法にて検討した。メタロチオネインプロモーターの性質から予想される様にp210^bcr/ablmRNAは様々な臓器に発現を認めたが、白血病を発症しない3ラインにおいてはp210^bcr/ablmRNAの発現は脳、腎臓といった造血器以外の臓器で認めるのに対し、繰り返し白血病を発症するラインにおいては造血器である胸腺に発現を認めた。この結果は、胸腺におけるp210^bcr/ablmRNAの発現が繰り返し発症するT細胞性白血病の原因となっていることを示唆すると共にp210^bcr/ablの個体レベルでの造腫瘍性は造血器特異的である事を示しており、実際の臨床においてPh¹染色体が造血器腫瘍に限って認められるという現象に動物モデルの面から根拠を与えるものである。

　3・臨床的にはp210^bcr/ablはCML、ALLで認められるのに対し、メタロチオネインプロモーターを用いたp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスではALLの発症しか認められていない。この問題を解決する目的で、本研究では新たに造血系前駆細胞で高い発現が認められるtec遺伝子のプロモーター領域約2kbのクローニングを行い、塩基配列の決定、転写開始点の決定およびプロモーター活性を確認を行った後、これを用いてp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスの作製を行った。その結果、ファウンダーマウスはALLを発症したのに対し、子孫のトランスジェニックマウスにCMLによく似た顆粒球増多を呈するマウスが出現した。ALLマウスは胸腺、脾臓、および皮下リンパ節の腫大を呈したのに対し、CMLマウスは脾臓および腸管リンパ節の腫大を呈した。ALLマウスでは、末梢血で幼若なリンパ芽球の増殖を認め、胸腺および脾臓も白血病細胞の浸潤を認めたのに対し、CMLマウスでは末梢血は成熟顆粒球がほとんどを占め、骨髄は著明な骨髄性細胞の過形成を呈し、腫大した脾臓およびリンパ節にも成熟顆粒球の増殖を認めた。Flow cytometryを用いた表面抗原の解析ではALLマウスの白血球はThy1.2というリンパ球の抗原を、CMLマウスの白血球ではGr-1という顆粒球系の抗原を高発現しており、各々の白血病細胞はリンパ球系および顆粒球系にcommitしていることが確かめられた。ALLマウスの腫瘍臓器ではp210^bcr/abl蛋白質の発現を認め、またCMLマウスの末梢顆粒球でp210^bcr/abl由来のmRNAの発現を認めた。CMLマウスについてその末梢血の血算および血液像の変化を経時的に検討したところ、血算は生後6ヶ月くらいから徐々に白血球の増加が始まり、それに伴って血液像では徐々に成熟顆粒球が増加している像が得られた。この結果はこの病態が慢性に経過していることを示しており、ヒトCMLの臨床経過に良く一致する。更に1匹のCMLマウスでは肺に芽球の増殖を認め、髄外性の急性転化の可能性が示唆された。以上の結果から、トランスジェニックマウスの系を用いてp210^bcr/ablはCMLおよびALLという臨床的に異なる疾患の発症に関与しうることを初めて証明した。

　4・これらのp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスは骨髄移植実験により作製されたマウスに比べて以下の利点があると考えられる。(1)骨髄移植実験では骨髄細胞を度in vitroで培養しp210^bcr/ablを発現するレトロウイルスを感染させるが、発症する血液腫瘍がin vitroでの培養条件により大きく影響を受けることが知られている。また、移植に際して産生されるサイトカインによる影響も無視できない。この点、トランスジェニックマウスは外来性の因子の影響を受けにくく、安定して再現性の良い系である。(2)導入したトランスジーンは安定に子孫に伝わるので、トランスジェニックマウス同士の掛け合わせ、またはトランスジェニックマウスとノックアウトマウスとの掛け合わせ等によりin vivoにおいてp210^bcr/ablの造腫瘍性の増強あるいは抑制作用を検討することが可能である。(3)骨髄移植実験ではerythroleukemia、macrophage tumor、reticulum cell sarcomaの様に臨床的にPh¹染色体を認めない造血器腫瘍の発症が観察されるのに対し、トランスジェニックマウスではPh¹染色体を有するCML、ALLのみが発症しており、より正確に生体内におけるp210^bcr/ablの造腫瘍性を反映している可能性がある。

　本論文は2種類のプロモーターを用いてp210^bcr/ablのトランスジェニックマウスを作製しその解析を行ったものであり、初めての白血病マウス作製の成功例である。本研究はp210^bcr/ablの生物学的作用およびその造腫瘍性に新らしい知見を加えるとともに新たなPh¹陽性白血病のモデルマウスを確立したものであり、学位の授与に値するものと考えられる。