角膜は眼球の前方に存在し、レンズとして働く透明な組織である。その透明性が保たれることは、視力保持の為に非常に重要である。そのなかでも角膜内皮細胞は角膜の透明性維持に重要な働きをしている。内皮細胞は種々の眼内手術操作により傷害されると、細胞密度の減少により水疱性角膜症に至ってしまう可能性がある。このため老人や糖尿病患者などの角膜内皮細胞に影響のある状態に対し角膜内皮細胞密度を増加させる治療が求められており治療法の開発が望まれる。その可能性を探るために、まず生体内と同じような角膜内皮細胞の培養条件を作り、そこでの角膜内皮細胞の増殖制御について検討した。

　実験1:培養角膜内皮細胞の増殖制御についての研究

　材料と方法

　ウシ角膜内皮細胞を継代培養し実験を行った。

　ヒトリコンビナントアクチビンA(味の素社)、ヒトリコンビナントPlatelet derived growth factor-AA、-BB(PDGF-AA、-BB)(ベクトン ディキンソン社)、ヒトリコンビナントTGF-1、TGF-2(R&D社)、スタウロスポリン、カルフォスチンC、KT5720、KT5823、ウオルトマンニン(協和メディクス社)。抗PDGF-AA、AB、BB抗体はゲンザイム社製を用いた。

　1)TGF-受容体の発現

　放射性ヨードでラベルしたTGF-1を用いて、アフィニティークロスリンク法および免疫沈降法を行った。

　2)BrdUの取り込みに関する実験

　細胞周期のG0/G1期からS期への進行状態を細胞核への5-bromo-2’deoxyuridine(BrdU)の取り込みで調査した。subconfluentの状態と、なるべく生体内での状態に近づけるためにconfluentの状態まで培養した角膜内皮細胞に、10g/mlのBrdUを添加しさらに12時間培養した。標本上の8.6mm²の範囲で染色陽性の細胞を計測した。

　3)MTT比色定量法

　TGF-の添加による経時的細胞数の変化を調べるためMTT比色定量法を行った。

　4)Western blotting

　TGF-により角膜内皮細胞がPDGFを産生しているかを調べた。PDGF含有量の計測のためのサンプルとして培養液を用いた。

　調査 1:角膜内皮細胞の形態変化に関する調査

　正常者および糖尿病患者における角膜内皮細胞の変化を検討するため、甲南社製非接触型スペキュラーマイクロスコープ:SP-8000を用いて角膜内皮細胞の観察を行った。各年代別に細胞密度、変動係数、六角形細胞出現率を測定し解析を行った。

　今回の実験結果からは、まず培養角膜内皮細胞に蛋白質レベルでのTGF-の特異的な受容体(TGF- type I、type II、エンドグリン)の発現が初めて確認された。ヒト角膜内皮細胞ではtype III受容体の発現が免疫組織化学的手法で確認されている。培養系と生体内でのTGF-の作用は受容体の発現により多少異なる可能性も考えられる。

　今回の実験系で培養角膜内皮細胞にエンドグリンの発現が確認されたことは、TGF-2よりもTGF-1のほうがより強い作用を示すことを意味する。なぜなら、エンドグリンはTGF-2よりもTGF-1とTGF-3に親和性をもつと報告されている。

　この実験系では培養角膜内皮細胞に対し、TGF-は増殖促進作用を示した。TGF-を長時間作用させた時には内皮細胞が密になりドーム状に隆起して増殖していた。この実験結果よりTGF-には部分的ではあるが、細胞密度を増加させる可能性があると推測された。

　最近、TGF-のシグナルはSmadファミリーの因子を介して伝達され、活性化されたtype I受容体により燐酸化されると報告されている。最終的に血液細胞、上皮細胞、血管内皮細胞などの多くの細胞で、retinoblastoma gene productの燐酸化を抑制することによりG0/G1期からS期への細胞周期の進行を抑えている。しかしながら、TGF-は線維芽細胞、角膜内皮細胞などの細胞で細胞周期を進行させた。TGF-による細胞周期進行のメカニズムはいまだよく分かっていない。そこにはいろいろなシグナル伝達経路や因子が複雑に関与していると推測される。

　我々は、TGF-とPDGFの共同作用を調査した。培養角膜内皮細胞は10%FBSの存在下でPDGF-B鎖を産生した。TGF-1の刺激作用はPDGF-BB、PDGF-ABに対する抗体で抑制された。これらの結果は、細胞周期の進行がTGF-1とPDGF-BBの両者が存在することによって引き起こされたことを意味する。PDGFのシグナル伝達抑制因子であるstaurosporineとwortmanninがTGF-1の作用を抑制したことはこれらの結果を裏付ける証拠となる。しかし、TGF-1とPDGF-BBの作用だけでは培養角膜内皮細胞の細胞周期の進行は促進されなかった。

　今回の研究の眼科臨床における意義は、まずスペキュラーマイクロスコープにより測定した加齢変化に伴う細胞密度の減少と、正常者と糖尿病患者の角膜内皮細胞の形態変化により問題提起される。測定結果より、正常群、糖尿病群の各群で加齢による細胞密度の減少が確認された。そして両群間での比較では、糖尿病群において50代で細胞密度の減少、40代で変動係数の高値、70歳以上で六角形細胞出現率の低下が認められた。今回の結果からも糖尿病では角膜内皮細胞に対し影響を及ぼしていることが確認された。糖尿病患者の角膜内皮の変化は、ポリオール代謝の亢進や房水の組成変化が関与していると推測されている。そして今回は高グルコース濃度におけるTGF-1の作用を検討したが、今後はより生体内の状態を想定した培養条件での検討が、眼科臨床の意義につながるものと思われる。

　そして臨床への応用を考えたとき、TGF-1、PDGF-BBとともに細胞周期の進行を引き起こす第3の因子を調査することが必要である。TGF-とPDGFと第3の因子を用いることにより細胞増殖を促進させ、部分的にでも細胞密度を増加させることが可能になるかもしれない。

　今回の実験系では生体内の状態に近いconfluentの状態にして実験を行っているため、得られた結果はヒトに対しても十分期待のできるものであると思われる。ヒトに対して有効であるためには、増殖の程度をcontrolできることが必要になる。特に糖尿病眼では虚血性疾患のため、TGF-やPDGFを作用させて副作用となる新生血管の誘発を起こす危険がある。そして、増殖がcontrolできない場合は際限なく増殖を続け、いわゆる癌化を生じてしまう可能性も否定できない。

　投与法についての検討をした場合、これには必要とされる遺伝子のみを導入する遺伝子治療が考えられるべきであろう。例えば、将来可能性のあるヒト角膜内皮細胞の移植の際に、TGF-、PDGFおよび第3の因子を導入した角膜内皮細胞を使用することで治療成績の向上につながる可能性が期待できる。

　この研究は、培養角膜内皮細胞におけるTGF-の臨床応用への可能性を目的としたものである。そして、TGF-の作用はPDGFおよび第3の因子との共同作用により行われていることが確認された。この研究では、正常角膜内皮細胞の細胞周期の制御に対する調査の最初のステップとなり、老化、糖尿病を始め他の角膜内皮細胞に影響を及ぼす疾患の治療法の開発につなげることが今後の課題である。