従来、筋収縮における細胞内Ca²⁺の重要性はよく知られていたが、ホルモン・神経伝達物質・受精などの、種々の生体機能においても細胞内Ca²⁺濃度の変化を介した情報伝達機構が重要である事が知られる様になってきている。

　細胞内Ca²⁺が有効なセカンドメッセンジャーとして機能するためには最低2もしくは3つの重要な機能が働く事が必須である。一つは基礎状態で細胞内Ca²⁺を低く維持する機構、そしてもう一つはその細胞内Ca²⁺を細胞外部からの刺激に応じて上昇させる機構であり、これには細胞膜Ca²⁺チャネルを通じた細胞外からの流入と、イノシトール1,4,5-三リン酸(InsP₃)を介したInsP₃受容体Ca²⁺チャネルを持つ細胞内プールからのCa²⁺放出機構がよく知られている。更に、最近、細胞内Ca²⁺はregenerative Ca²⁺ signaling(自己再生的Ca²⁺シグナル)と呼ばれる2つの機構、すなわちCa²⁺ oscillation(Ca²⁺振動)とCa²⁺ wave propagation(Ca²⁺波伝播)を介して情報伝達にあずかっている事もわかってきている。Ca²⁺振動は、たとえばホルモン量という細胞外アナログ情報を、振動の周波数という細胞内デジタル情報として伝達・記憶していると考えられる極めて興味深いメカニズムである。このCa²⁺振動発生やCa²⁺波伝播には細胞内Ca²⁺プール、及びその構成要素としてのCa²⁺チャネル、Ca²⁺ポンプ、Ca²⁺結合蛋白などが極めて重要である。

　自己再生的Ca²⁺シグナルのメカニズムとしては古くからInsP₃-Ca²⁺-cross-couplingモデルが提唱され、つい最近、東大飯野教授のグループによりその存在が実証された。もう一つの考え方として、Ca²⁺によるCa²⁺の放出という正のフィードバック機構をその主機構に据えたCa²⁺-sensitized InsP₃-induced Ca²⁺ release(CSIICR)モデルとCa²⁺-induced Ca²⁺ release(CICR)モデルも提唱されてきた。Ca²⁺がCa²⁺放出を誘発するという現象自体は筋小胞体におけるその存在が古くより知られていたが、筋細胞以外での自己再生的Ca²⁺シグナルへの普遍的・生理的な関与、という点では実証が進まず、一部の細胞でCSIICRモデルが示されているに過ぎなかった。

　最近になり、cyclic ADP ribose(cADPR)という全く新しい細胞内Ca²⁺放出因子がウニ卵より発見された。私は、この新しいメッセンジャーがCICRモデルの重要な仲介分子足りうると考え、その解析を通じて非筋細胞でのCICR機構の実在を検証する事を計画した。即ち、本研究は、ホルモン反応性細胞と卵細胞を用い、細胞内Ca²⁺を介した細胞内情報伝達の機構の一端を解明することを目的としている。

　実験のモデル系としてラット下垂体GH₄C₁細胞をまず用いた。その理由はGH₄C₁細胞が視床下部ホルモンであるTRHの刺激によりTRH受容体→フォスフォリパーゼCを介したInsp₃-細胞内Ca²⁺上昇を来す事、細胞内Ca²⁺に依存したCa²⁺振動が観察できる事、さらにこれがCICRの調節因子であるカフェインにも反応する事が知られている事など、この細胞でCICRモデルに基づくシグナル機構が働いている可能性が強く示唆されたからであった。そこで、我々はこの細胞にCICRに関与するCa²⁺貯蔵プールが存在する可能性を検証する目的で、この細胞のCa²⁺プールの特性をCa²⁺チャネルおよびCa²⁺ポンプの観点から解析した。

　まずGH₄C₁細胞内Ca²⁺の分布様式をそのCa²⁺チャネルの特性毎に解析した。この目的で細胞内小胞体に直接アプローチできるpermeabilized細胞系と、これを更に精製したmicrosome浮遊系を開発・使用した。この二つの系で、細胞内Ca²⁺-ATPase阻害剤であるthapsigargin(Tg)および、InsP₃の作用様式を解析した結果、GH₄C₁細胞には2組の異なるCa²⁺チャネル/Ca²⁺ポンプの組合せを持つ3種類以上のCa²⁺貯蔵プールが存在することが明らかとなった。次に、細胞内Ca²⁺の平衡状態を基礎状態、及びTgでCa²⁺-ATPaseを止めた状態、の両者につき解析することによりCa²⁺の細胞内での機能的分布を推量する全く新しい簡便な計算式を導いた。この計算式を用いてこれらのプール間のCa²⁺の分布を推量したところ、従来の説とは異なるCa²⁺分布状態にあるらしい事が判明した。また、この平衡式をCICR誘発剤カフェインでCa²⁺を放出させる前後にあてはめて細胞内Ca²⁺の動きをみたところ、これらの内、少なくとも一つのInsP₃非感受プールがCICRに関係しうると考えられた。

　まとめると、GH₄C₁細胞には

　1)Tg感受性Ca²⁺-ATPaseとInsP₃感受性Ca²⁺チャネルを有する。

　2)Tg感受性Ca²⁺-ATPaseを持つがInsP₃感受性Ca²⁺チャネルを持たない。

　3)Tg非感受性Ca²⁺-ATPaseと、CICRに関連するCa²⁺チャネルを持つ。

　の3つの異なるCa²⁺プールが存在すると考えられた。

　この第3のプールの詳細な解析に進む上で、この頃、InsP₃に並ぶ新しいCa²⁺放出因子として発見・報告されたcyclic ADP-ribose(cADPR)に注目した。この当時、動物細胞ではCICRプールの内因性アゴニストは知られておらず、また非筋細胞ではCICRの存在すら証明されていなかったが、ウニ卵でCa²⁺振動やCa²⁺波伝播がみられる事、卵細胞がCICRまたはCSIICR様の挙動を示す事、などよりCICR機構は、非筋細胞にも存在し、cADPRが動物非筋細胞CICRの内因性アゴニストである可能性が考えられたからである。

　まず上述と同じpermeabilized GH₄C₁細胞やmicrosome浮遊系にcADPRを作用させCa²⁺の放出反応を探ったが、これは再現性を持っては観察できなかった。そこでこの解析は凍結し、まずcADPRのCa²⁺放出の機構をウニ卵ホモジネートを用いて解析することにした。

　ここで、ウニ卵におけるcADPRによるCa²⁺放出反応はCa²⁺やカフェインの共存により増強される事、この増強現象はInsP₃によるCa²⁺放出に対しては見られない事をまず発見した。また卵ホモジネート濃度を変えたときのcADPRによるCa²⁺放出用量曲線の変化より、cADPRによるCa²⁺放出反応には、何らかの細胞質性可溶性因子が増強因子としてかかわっていることも推測された。次に、この因子は、添加実験および抑制剤を用いた薬理学的実験により、カルモデュリンである可能性が高いことが判明した。更に、Ca²⁺放出反応の時間経過を詳細に追ったところ、カルモデュリンの存在は、cADPRによるCa²⁺放出の初期相にはあまり関与せず、後期相により関与している事が考えられた。これらの発見・解析結果をもとにcADPR/Ca²⁺・カルモデュリン/カフェイン等の相互作用の仮説を立てた(模式図)。細胞が外から刺激されcADPRが増えると初期相(模式図中、initial phase)の少量のCa²⁺放出が起きる。放出されたCa²⁺はCaMと結合し、自身または近傍のCa²⁺チャネルの第2の調節ドメインを活性化、さらなるCa²⁺放出を引き起こし後期相(模式図中、potentiation phase)を形成し、これがCa²⁺波として伝播してゆくというものである。このモデルは今回の観察すべてをうまく説明しうる。

CADPR・Ca2+・カルモデュリンの相互作用によるCICRのモデル

　この仮説が正しいとすると、cADPR及びカルモデュリンが予め存在する状態では、添加Ca²⁺に同期したCa²⁺放出、即ち真のCICRが起こせることが予想される。実際、このモデル以降の実験では、Ca²⁺添加のみでCa²⁺放出を再現性良く誘発できることが実験的に示された。この特性からしてcADPRはセカンドメッセンジャーと呼ぶよりモデュレーターでありCa²⁺こそがトリガー兼セカンドメッセンジャーと捉えた方が適切と考えられた。

　上述の作業仮説をもとに、GH₄C₁細胞の実験に戻ってみたが、カルモデュリン共添加だけではcADPRによるCa²⁺放出反応は観察できず、またcADPRとカルモデュリン共存状態でのCICRも観察できなかった。この様に、哺乳類非筋細胞の自己再生的Ca²⁺シグナルにおけるcADPR誘発性CICRの生理的意義については未解決の部分も多い。しかし、私の観察・モデルをもとに、或いは平行して、この分野の研究が少しずつ進歩しつつある。今後、このcADPRの作用を更に詳細に解析し、哺乳類細胞での細胞内Ca²⁺情報伝達、特に自己再生的Ca²⁺シグナル機構をさらに解明してゆくことが必要である。