実験対象としてニホンザルの成獣6頭を用いた。認知的長期記憶課題としてサル3頭に視覚性対連合課題を行わせた。また別の3頭には対照用課題として図形弁別課題を課した。視覚性対連合課題は、予め無作為に対をくんだ複数の図形のセットを用いて、モニターに手がかり刺激となる図形が提示された後、選択刺激として提示された2つの図形の中から提示された手がかり図形の対図形を選ぶことが要求される課題である。この課題を遂行するためには、図形と図形の連合の長期記憶が必要とされる。一方、図形弁別課題の一試行では2つの対になった図形が同時にモニターに選択刺激として提示され、そのうちの一方の図形が常に正解である。この課題では特定の図形と報酬の連合の記憶が必要とされる。このように2つの課題の記憶に対する要求は異なるが、それぞれの課題において提示される刺激図形や報酬、試行中の運動量等記憶に直接関係のない要素は可能な限り2つの課題間で同じ条件に揃えた。本実験では図形に対する連合学習の成立と遺伝子発現の関係を探ることが目的であるため、課題のルールや手順等、図形の記憶に関係のない学習要素の関与も除外したい。そこで図形セットを2つ用意しておき、最初の図形セットを練習用セットとして用いてトレーニングを行い、まず課題のルールをサルに学習させた。その後、新規の図形セットに切り替えて課題を行わせることにより、新しい図形の記憶の形成を試みた。図形セットを切り替えた直後のサルの正答率はほとんど偶然のレベルになるがトレーニングを続け試行を重ねるうちに正答率は徐々上がってくる。このとき正答率が上限レベルに達するまでの間は新しい図形の記憶が徐々に形成されていると考えられる。このような学習途上段階での一日のトレーニング終了直後に、サルを4%パラフォルムアルデヒドにて灌流固定し大脳を取り出した。取り出したサル大脳はクライオスタットにて凍結切片を調製し、内側側頭葉辺縁系および下部側頭葉新皮質から得た凍結切片を免疫組織染色法により解析した(Okuno et al.,1995,1997)。

　まず私は、前初期遺伝子によってコードされる転写制御因子の一つ、Zif268に対する抗体でサル下部側頭葉を調べた。その結果、図形対連合課題を課した3頭のサルではいずれも下部側頭回付近に強いZif268の発現がみられた。Zif268の発現は神経細胞特異的であり、下部側頭回のなかでも嗅周皮質の36野にZif268を強く発現している神経細胞がパッチ状に局在する傾向が見られた。パッチ状の領域内においてZif268発現細胞は細胞層第4層を中心として、2/3層の浅層および5・6層の深層の両方に広がっていた。一方、対照課題である図形弁別課題を行ったサルの免疫染色切片においてもZif268の発現は見られたが、Zif268発現細胞は4層に限局しており、対連合課題を行ったサルと比べるとZif268の発現量は低かった。また、下部側頭回付近においてZif268発現細胞のパッチ状の分布は観察されなかった。海馬や嗅内皮質においてはZif268の発現は対連合学習と図形弁別学習間に差はみられなかった。次に私はZif268の分布を調べるため、前後軸方向に0.5mm毎に免疫染色した前額断切片から側頭葉におけるZif268発現の二次元マップを作成した。対連合学習時のZif268発現マップでは3頭のサルいずれにも、Zif268の発現が高いスポットが嗅周皮質36野の一部に認められた。図形弁別学習時のZif268発現マップでは、そのようなスポットはみられなかった。これらの結果は、視覚性対連合学習時に側頭葉の周嗅皮質36野においてZif268の発現が活性化されることを示唆する。

　さらに私は前初期遺伝子によってコードされている他の転写制御因子c-FosとJunDの発現パターンも同様に調べた。しかし、これらの転写制御因子の発現パターンには対連合課題を行ったサルと図形弁別課題を行ったサルの間で差はみられなかった。これらの結果から、図形対連合学習中に下部側頭回にみられたZif268の発現は、前初期遺伝子全般に見られる現象ではなく、また、課題依存的に選択的に誘導されたものであると考えられる。

　次に、免疫組織化学によって示された対連合学習中と弁別学習中におけるZif268の発現の差を定量的に調べるため、私はmRNA発現レベルの定量的解析を行った。実験対象としてニホンザルの成獣5頭を用いた。先ほどの実験と同様、サルには視覚性対連合課題と図形弁別課題を課した。この実験では動物個体間の遺伝子発現レベルの違いによる影響を克服するため、同一個体に二つの課題を同時に行わせた。視野の左右別々に刺激図形を提示することにより、左右それぞれの大脳半球を用いて2つの学習を独立に行わせることが可能である(Hasegawa et al.,1998)。左右の大脳半球それぞれに対連合課題と図形弁別課題を遂行して、先ほどと同様に学習途上段階のサルを用意した。トレーニング終了直後、速やかに大脳を取り出し、左右半球別に一次視覚野、側頭葉連合野TE、嗅周皮質36野、海馬のそれぞれより全RNAをGTC/CsTFA法により調製した。RNAサンプルは定量的RT-PCR法の一つ、共増幅法により解析し(Okuno et al.,1999)、zif268 mRNAの発現レベルを決定した。その結果、36野においては、対連合学習半球のzif268 mRNA発現レベルは図形弁別学習半球に比べ有意に高いことが示された(P<0.05 paired t-test)。その他の視覚および視覚関連領域では対連合学習中と図形弁別学習中におけるzif268 mRNAの発現レベルに差はなかった。また、個々の個体別に対連合学習と図形弁別学習におけるzif268 mRNAの発現レベルの比を求めると、36野においては1.26±0.07%であり、有意に1と異なった(P<0.05)。一次視覚野、TE野、海馬においては、対連合学習/対連合学習の比は、いずれもほぼ1であった。これらの結果から、対連合学習時にはzif268 mRNAの発現レベルが嗅周皮質36野において特異的に上昇していることが示唆される。