シオノギ研究所において、微生物発酵液由来のPLA₂阻害物質の探索研究を行った結果、カビより一連のチエロシン関連化合物を見出した。この中で、チエロシンB3はヒトIIA型PLA₂に対して強い阻害活性を示したが、微量成分である為、発酵液からの大量精製が困難であり、かつ溶解性が低い等の欠点を有しており、医薬品創製の観点からは物性の最適化を含めた合成的検討が必要とされた。そこで、チエロシンB3の構造を基に式Aで示される化合物群の合成を計画し、図4〜7に従ってこれらチエロシンB3誘導体の合成を行い、ラット及びヒトIIA型PLA₂、ヒトIB型PLA₂に対する阻害活性を測定した。これらの化合物の中には、ヒトIIA型PLA₂に対してチエロシンB3と同等の阻害活性を有するものもあったが、高活性には6個の芳香環が必要であり、分子量の低減や溶解性の改善を達成するには至らなかった。そこで次に、より効率的に創薬研究を行う目的でin vitroにおけるscreening系の最適化を行った。

　PLA₂阻害薬の評価において最も問題となるのは、基質であるリン脂質の量的なバランス及び物理化学的性状である。今までの報告には、リポコルチンを始めとして基質に直接作用することにより見かけの酵素阻害活性を示す、非特異的阻害剤が多く見られる。これらの問題点の改善策として、(1)酵素反応を安定化させるために高い基質濃度を用いること(2)基質の存在状態を安定化させるために界面活性剤との混合ミセル状態にする等の工夫が重要である。また、高次評価のためには薬理検体や生体サンプルのPLA₂活性測定法も検討する必要がある。

　それらを総合的に考慮し、本研究ではin vitro screening系として次のフローを設定した。

　炎症性腸疾患(Inflammatory Bowel Disease、以下IBD)は、数十年におよぶ多面的な研究にも拘わらず成因は不明であり、難治例が多いため厚生省特定疾患(難病)指定を受けている。治療薬としてはプレドニゾロン(ステロイド)、スルファサラジン(SASP)、メサラジン(5-ASA)が使用されているが、これらの薬剤をもってしても寛解の維持は難しく、寛解・再燃を繰り返す。

　近年、IBD患者血清中にIIA型PLA₂が高濃度に存在しており、血清中PLA₂濃度とIBDの重症度の間に相関がみられること、またIBD患者の腸の病変部においてIIA型PLA₂の高発現がmRNAおよび蛋白レベルで報告され、IIA型PLA₂のIBDへの関与が強く示唆されている。

　そこでIBDの疾患モデルとして汎用されている硫酸デキストランナトリウム(DSS)誘発潰瘍性大腸炎をラットに作成し、本モデルの病態形成におけるIIA型PLA₂の関与について調べるとともに、IIA型PLA₂阻害薬である化合物27の効果を検討した。

　大腸(結腸および直腸)は、薬物投与開始14日後に摘出し、大腸の長さを測った後、びらん領域の面積を測定した。

　PLA₂活性は3%のDSS飲水開始6日後からびらんが発生する大腸下部でのみ上昇し始め22〜25日後には17〜19倍に上昇した。びらんがほとんど認められない大腸上部ではいずれの時点でもPLA₂活性の有意な上昇は認められなかった。

　びらん発主部位である大腸下部に強い免疫染色が認められ、陽性反応の強さの順序は粘膜固有層＝粘膜筋板≧粘膜下層の血管＝粘膜下層>吸収上皮細胞の順であった。IIA型PLA₂免疫陽性反応の特異性を確認するために、隣接薄切標本を用いてIB型PLA₂の免疫組織化学を行ったが、いずれの標本においても陽性反応は全く認められなかった。

　化合物27は、びらん面積、大腸萎縮のいずれに対してもそれぞれ62%(p<0.01)および33%(p<0.01)の有意な改善を示し、現在最も有効な治療薬と考えられるプレドニゾロンと同程度であった。また、大腸組織中のPLA₂活性は、正常ラットの12倍に増加していたが、この増加は阻害薬によってほぼ完全に阻害された。一方、プレドニゾロンはPLA₂活性に影響を及ぼさず、化合物27とは異なる作用機作である可能性が示唆された。大腸炎により増加したPLA₂活性がIIA型PLA₂に由来するか否か確認する為に、試料にEDTA、抗ラットIIA型PLA₂抗体を試験管内で添加した。その結果、PLA₂活性は5mM EDTAで4.5%、抗体で19.2%まで減少したことから、PLA₂活性の大部分はIIA型に由来することが確認されたが、それ以外のPLA₂の関与も示された。以上により、本モデルの病態形成にIIA型PLA₂が大きく関与していること、さらにIIA型PLA₂阻害薬が新規のIBD治療薬となる可能性が強く示唆された。