マウス骨髄由来マスト細胞をIgE/抗原で刺激すると、一過的にcPLA₂活性が上昇した。[³²P]リン酸でラベルしたマスト細胞をIgE/抗原で刺激し、細胞ライゼートを抗cPLA₂抗体で免疫沈降し電気泳動で分離後、オートラジオグラフィー解析した結果、cPLA₂活性上昇と並行してcPLA₂がリン酸化されることを見いだした。

　細胞内Ca²⁺濃度を上昇させる刺激によって、cPLA₂は刺激に伴い形質膜ではなく核周辺膜に移行することが知られている。そこで、cPLA₂を強制発現したヒト胎児腎由来細胞株293を材料に用いて、蛍光抗体染色法によりcPLA₂の細胞内分布を検討した。無刺激細胞ではcPLA₂は細胞質全体に分布していたが、A23187で刺激した細胞では核周辺部に強い蛍光が観察された。cPLA₂のリン酸化はこのような細胞内移行に必須ではないことが報告されており、他の要因の関与を考える必要がある。そこで、私はこのcPLA₂の核周辺部への特異的移行にcPLA₂と相互作用する細胞内因子が関与することを想定し、本因子の同定を以下試みた。

　各種細胞ライゼートをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写した。この膜にグルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)融合cPLA₂を1%スキムミルク存在下添加した後、洗浄し抗GST抗体によるイムノブロッティングを行い、cPLA₂相互作用タンパク質を検索した。ラット腹腔マクロファージ、マウス骨芽細胞株MC3T3-E1細胞を試料として用いた結果、両細胞ともに、コントロールとしてGSTを添加した場合に明確なバンドは検出されなかったが、GST-cPLA₂を添加した場合にのみ分子量約60kDaのタンパク質(P60)が検出された。また、GSTとは異なるtagであるT7 peptideを融合したcPLA₂をプローブとしてFar-Western解析を行った場合にも、MC3T3-E1細胞、ラット線維芽細胞株3Y1細胞を用いた場合にP60が検出された。

　次に、本結合に必要なcPLA₂の部位を調べた。まず、cPLA₂のN末端に存在するC2ドメインに注目した。C2ドメインを完全に含むGST-cPLA₂(1-138)を作製し、Far-Western解析を行った。その結果、全長のcPLA₂を用いた場合と同様にP60と結合することが観察された。さらに、結合部位の詳細な解析を試みた。cPLA₂のC2ドメインのC末端側を削ったGST-cPLA₂(1-81)にはGST-cPLA₂(1-138)よりは弱いものの有意な結合が観察された。しかし、さらにN末端を削ったGST-cPLA₂(36-81)やGST-cPLA₂(1-35)には結合性が検出されなかった。過剰量のtagを持たないcPLA₂の添加実験を行った。バキュロウイルス発現系を用いて調製したリコンビナントcPLA₂をFar-Western解析の反応系に添加した結果、P60のバンドは著しく減少した。以上の結果から、P60はcPLA₂のC2ドメインに結合することが示された。

　C2ドメインはCa²⁺依存的にリン脂質と結合する機能単位として知られている。そこで、本結合へのCa²⁺の影響を検討した。まず、Ca²⁺キレート剤であるEDTAの影響を検討した。Far-Western解析の反応系に5mM EDTAを添加するとP60のバンドは検出されなくなった。次に、最近報告されたcPLA₂の立体構造解析に基づき、Ca²⁺との結合に直接関与するアミノ酸である43番目と93番目のAspを両方ともAsnに置換した変異体をプローブとして用いてFar-Western解析を行った。その結果、P60のバンドは検出されなかった。これらの解析から、cPLA₂とP60の結合にはCa²⁺が必要であることが考えられた。

　P60の細胞内分布を調べるために3Y1細胞を分画した。まず、3Y1細胞を1%NP-40で処理し、細胞質画分と核画分を遠心分離した。核画分を高濃度の塩で処理し、クロマチン画分と核マトリクス画分に分画し、それぞれの画分をFar-Western解析した。その結果、P60の大部分は核マトリクス画分に存在することがわかった。そこで、核マトリクス画分を電気泳動で分離後染色し、P60に相当するバンドを切り出し、消化酵素としてリジルエンドペプチダーゼを用いたクリーブランド法によるペプチドマッピングを行った。2つのペプチド断片のN末端アミノ酸を解読し、3Y1細胞より調製したcDNAを鋳型にdegenerate PCRを行った。得られたcDNA断片の配列を解読し、遺伝子データベース検索した結果、細胞骨格系の中間径フィラメントの主要構成成分であるビメンチンであることがわかった。実際に解読した2つのペプチド断片のアミノ酸配列がラットビメンチンの配列中に存在していたため、P60はビメンチンであると結論した。

　ヒト副腎皮質癌由来SW13細胞には、自然発生的にビメンチンを発現していない亜株が存在する。そこで、ビメンチン発現株と非発現株のライゼートをFar-Western解析あるいは抗ビメンチン抗体によるイムノブロットを行った結果、ビメンチン非発現株にはcPLA₂結合タンパク質及びビメンチンが共に検出されなかったのに対し、ビメンチン発現株に両方の解析で同様に検出された。従って、Far-Western法により検出された分子量60kDaのcPLA₂結合タンパク質はビメンチンであることが示された。

　溶液中でのcPLA₂とビメンチンの結合を調べた。あらかじめGST-cPLA₂(1-138)を結合したグルタチオンビーズを作製し、Ca²⁺存在下あるいは非存在下でリコンビナントビメンチンとインキュベートした後、ビーズに結合したタンパク質をグルタチオンで溶出し、抗ビメンチン抗体でイムノブロット解析した。その結果、Ca²⁺存在下でのみビメンチンの結合が検出された。従って、溶液中でもcPLA₂とビメンチンはCa²⁺依存的に結合することがわかった。

　cPLA₂とビメンチンが細胞内でも結合し得るか検討した。cPLA₂強制発現293細胞を材料に用いて、無刺激細胞とCa²⁺イオノフォア刺激細胞を免疫染色した後、両タンパク質の局在を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。cPLA₂はFITCの緑の蛍光で、ビメンチンはCy3の赤の蛍光で染色し、両者が局在が一致した場合黄色の像で表現される。無刺激細胞ではcPLA₂とビメンチンの分布はあまり一致していなかったが、A23187で刺激した細胞では黄色の像を示す細胞が数多く観察された。従って、細胞内でもCa²⁺濃度上昇に伴って、cPLA₂とビメンチンが結合する可能性が考えられた。

　本結合のアラキドン酸代謝への関与を調べるため以下の検討を行った。

　ビメンチン非発現SW13細胞にビメンチンcDNAを導入し、ビメンチンを強制発現した細胞株を樹立した。本細胞株と親株細胞をあらかじめ[³H]アラキドン酸でラベルし、Ca²⁺イオノフォア刺激により上清に遊離されるアラキドン酸量を比較検討した。その結果、ビメンチン発現細胞は親株細胞に比べて約2倍のアラキドン酸遊離を示した。つまり、細胞からのCa²⁺依存的なアラキドン酸遊離はビメンチンが存在すると効率良く進行したことから、細胞内でのcPLA₂/ビメンチン相互作用が機能的に必要であることを示唆している。

　次に、ビメンチン側のcPLA₂結合部位を検討した。ビメンチンは構造上3つのドメイン(中央部の繊維状構造をとるのに必須なロッドドメイン、N末端のヘッドドメイン、C末端のテイルドメイン)に分けられる。大腸菌を用いてビメンチンの各ドメインのみのリコンビナントタンパク質を作製し、Far-Western解析によるcPLA₂との結合を検討した。その結果、ビメンチンのヘッドドメインとのみcPLA₂は結合することがわかった。そこで、ビメンチンを構成的に発現している3Y1細胞にビメンチンのヘッドメインを過剰発現させた細胞株(3Y1-vim(1-125))を樹立した。本細胞株をCa²⁺イオノフォアで刺激したときのアラキドン酸遊離およびPGE₂産生を親株細胞と比較した。その結果、ビメンチンヘッドドメイン過剰発現細胞では親株細胞と比較して両反応とも有意に減少するdominant negative効果が観察された。以上の結果から、cPLA₂とビメンチンの結合がアラキドン酸代謝の正常な進行に関与することが考えられた。

　炎症性サイトカインであるIL-1/TNFで刺激した3Y1細胞における遅発的エイコサノイド産生は、cPLA₂/12/15-LOX代謝物がsPLA₂の発現誘導を引き起こし、別の経路で発現誘導されたCOX-2と協調してPGE₂産生を惹起することを明らかにした。

　LPS投与ラットの脳可溶性画分よりPGE₂合成酵素(PGES)の精製を行った。まず、脳可溶性画分を60-80%硫安分画し、透析した後、DEAE-Sephacelイオン交換カラム、Superdexゲルろ過FPLCで順次精製した。ゲルろ過FPLC後の精製品を用いて、クリーブランド法によるアミノ酸配列の解読を行った。その結果、遺伝子バンクに登録されているp23と呼ばれる機能が明らかでないタンパク質とほぼ完全に一致した。p23のアミノ酸配列にはGSTに共通に保存されている配列を有しており、新たなGST分子種である可能性が考えられた。