細胞内の5-HPETEレベルの変化を測定するため、化学発光高速クロマトグラフ法(CL-HPLC)による定量法を確立した。この方法により初めて細胞内の5-HPETEの測定が可能となり、A23187刺激によりラット好塩基球系白血病細胞RBL-2H3細胞内には、細胞107個あたり480±30pgの5-HPETEが蓄積したことが解った。そこで、この方法を用いて、酸化ストレスをかけたときの5-HPETEレベルの変化とロイコトリエン産生に及ぼす影響について解析した。細胞内の主要な還元力であるグルタチオンを枯渇させることによって酸化ストレスを負荷したところ、5-HPETEは著しく増加し、それに伴ってロイコトリエンの産生が高まった。

　酸化ストレスによるロイコトリエン産生の亢進の機序をより明確にするため、5-HPETEを代謝する抗酸化酵素グルタチオンペルオキシダーゼの組換え発現し、その結果もたらされる5-HPETEレベルの変動とロイコトリエン代謝系の関係を詳細に検討することにした。

　5-HPETEを代謝し、ロイコトリエン酸生を調節できるグルタチオンペルオキシダーゼとして、膜中の脂質ペルオキシドも代謝でき、核膜にも存在するPHGPxを考え、組換え発現することとした。

　得られた組換え細胞について、PHGPxの局在性を確認したところ、核に局在していることが解った。そこで、この細胞を用いて、ロイコトリエン産生能を検討したところ、PHGPx高発現によってロイコトリエン産生が著しく抑制されていることを見い出した。このロイコトリエン産生能の低下は、基質であるグルタチオンを細胞内から除くことによって解除される。したがって、PHGPxの酵素活性によるものであることが確認された。宿主に用いたRBL-2H3細胞は、高発現させたPHGPxに比べても、はるかに高い細胞質グルタチオンペルオキシダーゼ(cGPx)を有している。しかし対照の細胞からグルタチオンを除いてもロイコトリエン産生能は変化しなかった。このことは、ロイコトリエン産生の調節にはcGPxの寄与はほとんどなく、PHGPxが特異的にロイコトリエン酸生を調節していると考えられた。

　そこで、PHGPxの高発現が、ロイコトリエン生合成経路のどの部分に作用してロイコトリエン産生能の低下を引き起こしているのかを検討した。まず、最初にホスホリパーゼA2によるアラキドン酸の切り出しを検討したが、変化は認められなかった。次に、アラキドン酸からの代謝物をHPLCで分離して、PHGPxの高発現による代謝経路の変化を測定した。その結果、PHGPx高発現細胞では、以外にも5-HPETEから5-HETEへの代謝の増加は認められず、すべてのロイコトリエン代謝物の産生が低下していることが明らかになった。5-リポキシゲナーゼや、その活性を助けるFLAPタンパク質の発現量についても差はない。このことから、PHGPxの高発現によってアラキドン酸から酸素2原子が付加して5-HPETEを生成する、5-リポキシゲナーゼ活性そのものを抑制したと結論される。

　その原因として、5-リポキシゲナーゼの活性化因子としての脂肪酸ハイドロペルオキシドをPHGPxが制御している可能性が考えられる。そこで、まずPHGPxの高発現による細胞内ハイドロペルオキシド量の変化を、ハイドロペルオキシドによって蛍光を発する色素を指標に、フローサイトメトリーにより検討した。PHGPx高発現細胞では、刺激を受けても細胞内ハイドロペルオキシドレベルは低く保たれていた。細胞内のハイドロペルオキシドレベルは、少量の脂肪酸ハイドロペルオキシドを添加することで、対照の細胞のレベルまで回復させることができる。そこで、12-HPETEを添加して、PHGPx高発現細胞のロイコトリエン産生能に変化があるか検討した。その結果、12-HPETEを少量添加することによって、ロイコトリエン産生能は回復した。この効果は、12-HETEにはなく、また12-HPETEは5-リポキシゲナーゼの基質にはならないことから、細胞内の脂肪酸ハイドロペルオキシドレベルの回復によるものと考えられる。

　以上の結果から、5-HPETEなどの脂肪酸ハイドロペルオキシドやそれを代謝するPHGPxが、5-リポキシゲナーゼの調節因子として働くことが明らかになった。5-リポキシゲナーゼは、活性化に当たってその活性中心のヘム鉄が2+から3+に酸化される。脂肪酸ハイドロペルオキシドの作用機序として、この活性中心に酸化シグナルとして働いている可能性が強い。

　炎症やアレルギー反応の局所に浸潤する炎症細胞は、強い酸化ストレスにさらされている。このような環境下で、多形核白血球などの炎症性細胞は、脂質メディエーターであるロイコトリエンを産生している。そこで、これまで検討してきた細胞内ハイドロペルオキシドレベルによるロイコトリエン産生の調節機構が、このような条件下でどの程度寄与しうるのか検討した。

　カゼインを刺激剤として用い、浸潤してきた炎症細胞のグルタチオンペルオキシダーゼの発現量を検討すると、浸潤細胞ではいずれのグルタチオンペルオキシダーゼも発現量が低下していることが解った。とくに、PHGPxの発現量においてこの傾向は顕著で、腹腔に浸潤した多形核白血球では、ほとんど発現していなかった。ところがPHGPxの発現量の低下した多形核白血球を培養すると、発現量は回復した。一般に抗酸化酵素は、その性格からハウスキーピング酵素と考えられているが、PHGPxが特殊な環境下にあって発現量を著しく変化しうるということは、調節因子としてのPHGPxの役割を強く示唆する。そこで、培養の前後で、ロイコトリエン産生能を測定したところ、予想通りPHGPxの発現量が低下した浸潤細胞ではロイコトリエン産生能が高く、PHGPxの発現量が回復した培養後では産生能は低下していた。ロイコトリエン生合成系の酵素量に変化はなく、これまでの検討と同様にPHGPxの発現が低い状態では細胞内のペルオキシドレベルは高かった。これらの結果は、炎症細胞の浸潤過程でPHGPxの発現量を抑制する機序が存在し、その結果細胞内の脂肪酸ハイドロペルオキシド量が増加してロイコトリエン産生能を高めている、という可能性を強く示唆する。