ラット頭蓋冠(頭頂骨)から約95%の純度で採取した初代培養骨芽細胞を調製し、石灰化を誘導する刺激として-グリセロリン酸とアスコルビン酸を添加して培養し、コンフルエントに達した細胞を「day0細胞」と、さらに培地交換のみを繰り返しながら21日間培養した細胞を「day21細胞」とそれぞれ命名し用いた。Day21細胞については骨芽細胞の成熟化の指標である石灰化の亢進と骨芽細胞特異的分化マーカー発現が供陽性である事を確認した。つまり、本培養条件を用いることによって、石灰化を伴う成熟骨芽細胞(day21細胞)の試験管内培養系が確立できたと考えた。

　骨基質中には骨代謝を調節する様々な骨代謝調節因子が存在する。特に成熟骨芽細胞自身がが合成し、骨基質中に分泌し、骨芽細胞の機能を修飾する因子としてはtransforming growth factor-、fibroblast growth factor、bone morphogenetic proteinなどがあり、いずれも硫酸化多糖と結合して骨基質中に存在することが知られている。そこで、前章までの解析で明らかになったday21細胞で観察される効率のよいアラキドン酸代謝酵素系の発現誘導に関係する因子が、培養中に細胞の周辺に構築された骨基質様の細胞外マトリックスに局所的に蓄積されて作用した可能性を想定して解析を行った。

　具体的にはday21細胞のライゼートを調製してday0細胞に添加し、IL-1の刺激有無でPGE₂産生を調べた。その結果、成熟骨芽細胞には幼若骨芽細胞のPGE₂産生を増強する因子が存在していた。この因子は細胞外基質にあり、NaClで可溶化される熱不安定な因子であったが、骨芽細胞に作用してCOX-2発現を持続的に誘導することによってPGE₂産生亢進の一因となっていると考えられた(図2)。

図2.Day0細胞でのPGE₂産生の経時変化

　本研究により、石灰化を来すような成熟骨芽細胞がPGE₂の供給源としてきわめて大きな位置を占める可能性が強く示唆された。今後、本因子の詳細な解析により種々の骨疾患における位置付けが明らかにされるとともに、特定がなされることによって新規治療薬の可能性が示されるものと期待される。

　ラット頭蓋冠から95%の純度で初代培養骨芽細胞を調整し、-グリセロリン酸とアスコルビン酸を添加して培養、コンフルエントに達した細胞は幼若骨芽細胞の様子を示した。以後この細胞を"培養幼若骨芽細胞"として使用した。一方、この細胞をさらに培地交換のみを繰り返して21日間培養すると石灰化が進み骨芽細胞特異的分化マーカー発現が認められるようになった。この細胞は形態的に、又細胞化学的に成熟骨芽細胞と見なせることが分かり,以後この細胞を"成熟骨芽細胞"として使用した。

IL-1刺激骨芽細胞におけるPGE2産生の亢進

　幼若骨芽細胞と成熟骨芽細胞をそれぞれIL-1で刺激し、PGE2産生を時間を追って検討した。いずれの細胞も刺激後6〜10時間で産生量がピークに達した。幼若細胞ではこれ以上の変化は認められなかったが、成熟細胞ではさらに培養を続けると再度産生量が上昇し、72時間後にはPGE2量は6時間後の1000倍にも達した。従来の検討は幼若細胞における極めて微弱な反応を見ていたことになる。IL-1刺激成熟骨芽細胞におけるPGE2産生亢進のメカニズムを解明するために、ホスホリパーゼA2、シクロオキシゲナーゼI(COX-1)、シクロオキシゲナーゼII(COX-2)の活性を検討した。幼若細胞,成熟細胞いずれでもIL-1刺激により細胞質ホスホリパーゼA2活性(cPLA2活性)が亢進したが、比活性では成熟細胞のほうが3倍以上幼若細胞より高かった。COX-1活性には変動は認められず、COX-2の発現は幼若,成熟いずれも刺激後6時間まで上昇するが、成熟細胞でのみさらに72時間まで上昇を続けることも分かった。COX-2阻害剤でPGE2産生が完全に抑制されたことから骨芽細胞中でのプロスタグランジン産生への本酵素の重要性が示された。

　成熟骨芽細胞のライゼートを調整して、幼若骨芽細胞に添加して培養の後、PGE2産生を調べたところ、産生が著しく亢進していた。ライゼート中に幼若細胞におけるPGE2産生をうながす活性があることが分かり、さらに調べた結果この因子は細胞外基質(硫酸化多糖)に結合して存在する熱不安定な分子であることが判明した。

　本研究において石灰化をきたすような成熟骨芽細胞がPGE2供給源として大きな位置を占めることが示された。この細胞自身のPGE2産生が亢進しているのみならず、幼若細胞にも働きかけPGE2産生を促す活性もあることが明らかになった。骨に関する生理学、病態生化学の発展に寄与するところがあり博士(薬学)に値すると判定された。