ヒトなどの脊椎動物においては、血管新生、すなわち新たな血管の形成は、胎生期の循環系の発生のみならず、成熟固体での組織や器官の形成や再生においても必要不可欠の現象である。また、血管新生は、これら正常なもの以外にも、固形腫瘍の増殖や転移、リウマチ様関節炎、糖尿病性網膜症など、さまざまな疾患においてその病態形成に深く関わることが知られている。

　血管新生は、正常状態においては厳密なコントロールを受けており、血管内皮細胞の増殖と分化がその中心的な過程である。血管内皮特異的増殖因子(VEGF)は、ウシ下垂体細胞培養上清中に見い出された分泌型の糖タンパクで、内皮細胞特異的な増殖刺激作用とともに、生体内においては、血管新生を誘導し、血管透過性を亢進させることが知られている。VEGFは、上皮系や間葉系など、さまざまな種類の細胞において発現されており、これら細胞によって産生されたVEGFは、内皮細胞上に発現される受容体を介して、主としてパラクリン的に作用するものと考えられている。

　高親和性VEGF受容体としては、現在までに、Flt-1(VEGFR1)とKDR/Flk1(VEGFR2)の2つの受容体型チロシンキナーゼが知られているが、これらVEGF受容体は、細胞外ドメインの7個の免疫グロブリン様構造や、キナーゼドメイン内の約70アミノ酸のキナーゼ挿入領域など、互いに構造上の類似性を示し、生体内においては、ほぼ血管内皮細胞に限局して発現されることが特徴である。

　VEGFとその受容体は、さまざまな血管新生において、中心的な役割を果たすことが知られている。すなわち、正常胎仔における発現パターンや、ノックアウトマウスの解析結果は、VEGFと2つの受容体(Flt-1, KDR/Flk-1)が、いずれも、個体発生における正常な血管系の形成に必須の遺伝子産物であることを示している。また、VEGFは、種々のヒト腫瘍組織中において高発現が報告されており、腫瘍血管の形成など、病的な血管新生においても主要な血管新生因子と考えられている。

　VEGF遺伝子の発現誘導因子としては、現在までに、低酸素、低グルコースなどの代謝性因子や、成長因子、サイトカイン、性ホルモンによる刺激、さらには、腫瘍細胞にみられる遺伝子変化(癌遺伝子の活性化、癌抑制遺伝子の不活化)などが報告されているが、実際の生体内における発現調節機序については不明の点も少なくない。また、VEGF受容体の、内皮細胞特異的な発現に関わる分子機構については、ほとんど、知られていない。

　VEGFとその受容体遺伝子の発現調節機序を解明することは、血管新生の分子機構を理解し、血管新生の人為的コントロールによって、固形腫瘍の抗血管新生療法や血管病変に対する遺伝子治療に応用するにあたって重要であると考えられる。VEGFおよびその受容体の1つであるflt-1(VEGFR 1)遺伝子の発現調節について、分子生物学的手法を用いて解析を行い、以下の知見を得た。

1.　オカダ酸によるVEGF遺伝子の発現誘導:VEGF遺伝子発現調節におけるプロテインフォスファターゼ(PP)の関与

　VEGFの発現に関して、新たに、非12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TpA)-型腫瘍プロモーターであるオカダ酸(okadaic acid)が、その発現誘導因子であることを見い出した。

　オカダ酸は、海洋生物、クロイソ海綿より抽出されたポリエーテル化合物で、マウス皮膚の2段階発癌実験では強力な腫瘍プロモーターとして作用する。オカダ酸は1型および2A型のプロテインフォスファターゼ(PP1、PP2A)の特異的阻害剤であり、プロテインキナーゼC(PKC)を直接的に刺激するTPAとは異なった生化学的作用機序をもつとされる。

　多段階発癌実験における腫瘍プロモーションと、腫瘍血管新生との関係は必ずしも明らかではないが、これら化学発癌実験においても、腫瘍がある大きさを超えて成長する以上、なんらかの血管新生因子の活性化が起きていると考えられる。TPAは、培養細胞に対してVEGFの産生を亢進させることが報告されているが、オカダ酸についても、生理的濃度の範囲で各種培養細胞培養液中に添加したところ、数時間後にVEGF mRNA量の5-10倍の上昇を認めた。さらに、オカダ酸刺激後、培養上清中のVEGFタンパク量も著明に増加しており、VEGFは、オカダ酸による2段階発癌モデルにおいて、生体内における血管新生因子候補の1つと考えられる。

　しかし、オカダ酸によるVEGF遺伝子発現誘導は、TPAによるそれとは異なって、比較的緩序な時間経過で起こることが特徴的であり、その作用は、PKC活性に非依存的であった。また、オカダ酸の腫瘍プロモーション作用の内因性メディエーターとして注目される腫瘍壊死因子(TNFα)の関与についても、培養液中への抗TNFα中和抗体の添加によってもオカダ酸刺激後のVEGFmRNAの誘導は阻止されず、オカダ酸によるVEGF遣伝子活性化の機構として、TNF-αによるオートクリン的な作用機序は否定的であった。

　一方、オカダ酸と同様にPPlおよびPP2Aの特異的阻害剤であるトウトマイシン(tautomycin)にも、高濃度でのVEGF mRNAの誘導作用が認められた、トウトマイシンには、オカダ酸のような強力な腫瘍プロモーション作用やTNF-αの誘導作用は認められないことから、オカダ酸によるVEGF遺伝子発現誘導は、その腫瘍プロモーター活性やTNF-αの誘導能よりも、むしろ、プロテインフォスファターゼ(PP)活性の抑制に関達しているものと思われた。さらに、VEGF mRNAの誘導に必要なトウトマイシンの用量よりみて、PPのうちでは、PP1よりもPP2AAがVEGF遺伝子発現の制御に関わっていることが示唆されており、これらPPによって調節を受けるシグナル伝達系を明らかにすることによって、VEGF遺伝子の発現調節機構に関して新たな知見が得られるものと期待される。

2.　cAMPresponse element(CRE)とEtsモチーフによるVEGF受容体fit-1遺伝子の転写活性化:プロトオンコジーンc-ets-1による内皮細胞特異的発現調節

　VEGF受容体遺伝子の発現は、i)内皮細胞に特異的であること、ii)胎生期の血管新生が活発な時期においては特に高いレベルで発現されること、iii)成熟個体においても腫瘍血管などでは高発現されること、が特徴的である。従って、ゲノムDNA上には、VEGF受容体遺伝子の内皮細胞特異的な発現を調節するエンハンサー領域が存在し、胎生期や腫瘍組織において、その活性を発揮するものと想定される。

　VEGF受容体の1つflt-1(VEGFR 1)遺伝子の5'-隣接領域を単離し、flt-1 mRNAを発現する293E1細胞や内皮由来の細胞株を用いてchloramphenicol acetyl transferase(CAT)アッセイを行ったところ、転写開始点より上流約200bp の間に細胞特異的な転写調節領域が存在することが判明した。この領域には、1つのCREと5つのEtsモチーフが存在するが、さらに、これらモチーフに点変異を導入した結果、転写開始点の上流約50bp附近に存在するCREとこれに近接する1つのEtsモチーフのsynergistucな作用によってflt-1遺伝子の細胞特異的な転写活性が発揮されることを見い出した。これら2つのモチーフを含む約90bpのflt-1遺伝子上流領域のプロモーター活性は、Etsタンパク発現ベクターのco-transfectionによって著明に上昇し、また、ゲルシフト法によって、293E1細胞や内皮細胞の核抽出液中に、これらCREとEtsモチーフのそれぞれに特異的に結合するタンパク性因子の存在が確認された。

　鳥類の発生初期の内皮細胞や、ヒトの腫瘍血管において、Etsファミリーに属するタンパクの1つ、c-Ets-1の高発現が報告されている。本研究に用いた293E1細胞や培養内皮細胞にもc-Ets-1の存在が認められ、flt-1遺伝子の内皮細胞特異的な発現調節機構として、転写調節因子c-Ets-1による活性化が考えられる。

　個体発生や腫瘍組織での血管新生においては、VEGF-Fltシステムは、リガンド、レセプターの両者とも、高いレベルでの発現が誘導されることが報告されている。c-Ets-1は、内皮細胞において、VEGFを含むさまざまな成長因子による刺激に反応して、その発現が誘導されることが知られており、転写調節因子c-Ets-1を介するポジティブフィードバック機構は、血管新生における、VEGFとその受容体Flt-1、両者の協調的な高発現を説明するモデルの1つであると考えられる。

　本研究は、正常、および、病的な血管新生において、中心的な血管新生因子と考えられている血管内皮特異的増殖因子(VEGF)の発現誘導機序、および、VEGF受容体の1つであるFlt-1チロシンキナーゼの内皮細胞特異的な発現調節のメカニズムについて、分子生物学的解析を試みたものであり、以下の結果を得ている。

1.　VEGFの発現誘導因子として、あらたに、非12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)-型腫瘍プロモーターの1つであるオカダ酸(okadaic acid)を見い出した。すなわち、各種培養細胞培養液中に、オカダ酸を生理的濃度で添加したところ、数時間後にVEGF mRNA量の5-10倍の上昇がみられ、培養上清中のVEGFタンパク量も著明な増加を認めた。

2.　オカダ酸によるVEGF遺伝子発現誘導は、TPAによるそれとは異なって、比較的緩序な時間経過で起こり、PKCに非依存的であった。また、中和抗体を用いた実験からは、オカダ酸によるVEGF遺伝子活性化のメカニズムとして、オカダ酸の腫瘍プロモーション作用の内因性メディエーターとして注目される腫瘍壊死因子(TNF-α)によるオートクリン的機序は否定的であった。

3.　オカダ酸と同様に、1型および2A型のプロテインフォスファターゼ(PPl、PP2A)の特異的阻害剤であるトウトマイシン(tautomycin)にも、高濃度でのVEGF mRNAの誘導作用が認められた。トウトマイシンには、オカダ酸のような強力な腫瘍プロモーション作用やTNF-αの誘導作用は認められないことから、オカダ酸によるVEGF遺伝子発現誘導は、その腫瘍プロモーター活性やTNF-αの誘導能よりも、むしろ、プロテインフォスファターゼ、ことに、PP2A活性の抑制に関連しているものと思われた。

4.　VEGF受容体の、内皮細胞特異的な発現の分子機構を解明する目的で、VEGF受容体の1つflt-1(VEGFR1)遺伝子の5'-隣接領域を単離し、flt-1 mRNAを発現する293E1細胞や内皮由来の細胞株を用いてchloramphenicol acetyl transferase (CAT)アッセイを行ったところ、転写開始点より上流、約200bpの間に細胞特異的な転写調節領域が存在することが判明した。さらに、この領域に存在する転写因子結合モチーフに点変異を導入した結果、flt-1遺伝子の細胞特異的な転写活性には、転写開始点の上流、約50bp附近に隣接して存在する1つのcAMP response element(CRE)と1つのEtsモチーフのsynergisticな作用が必要であることを見い出した。

5.　ゲルシフト法によって、293E1細胞や内皮細胞の核抽出液中に、これらCREとEtsモチーフのそれぞれに特異的に結合するタンパク性因子の存在が確認された。鳥類の発生初期の内皮細胞や、ヒトの腫瘍血管において、Etsファミリーに属するタンパクの1つ、c-Ets-1の高発現が報告されているが、本研究に用いた293E1細胞や培養内皮細胞にもc-Ets-1タンパクの存在が認められ、flt-1遺伝子の内皮細胞特異的な発現調節機構として、転写調節因子c-Ets-1による活性化が考えられた。

6.　ヒト内皮由来の細胞にVEGFを作用させると、まず、c-ets-1 mRNAの、ついでflt-1 mRNAの発現誘導を認めた。個体発生や腫瘍組織での血管新生においては、VEGFとその受容体は、リガンド、レセプターの両者とも、発現レベルが上昇しており、転写調節因子c-Ets-1を介するポジティブフィードバック機構は、血管新生における、VEGFとその受容体Flt-1の協調的な高発現を説明するモデルの1つであると考えられた。

　以上、本論文は、非TPA-型腫瘍プロモーターであり、1型および2A型のプロテインフォスファターゼの特異的阻害剤であるオカダ酸が、VEGFの発現誘導因子の1つであることを認め、また、VEGF受容体の1つであるFlt-1の内皮細胞特異的な発現に、転写因子c-Ets-1が関わることを明らかにした。

　本研究は、主要な血管新生調節系であるVEGFとその受容体遺伝子の発現調節機構にあらたな知見を加え、血管新生の分子機構の解明に貢献をなすところ少なくなく、学位の授与に値するものと考えられる。