慢性心不全は左心室の機能不全による心臓のポンプ機能の低下を伴う疾患である。心不全の初期においては心機能の低下に伴い交感神経系が活性化し心筋の活動を促進して機能低下を補う。しかし慢性的な交感神経系の活性化は心筋細胞β2受容体を脱感作させる結果、応答性が低下し慢性心不全は悪化・伸展する。したがってβ2受容体の脱感作の抑制は心不全治療法の候補と考えられる。脱感作には、β2受容体細胞内C末端のリン酸化、受容体の発現量抑制、internalization等が関与する。β-Adrenergic kinase1(βARK1)は活性化β2受容体を選択的にリン酸化するとともに、β2受容体/β-arrestin複合体の形成を通じβ2受容体のinternalization等にも関与する(図1)。加えて、心不全患者ではβARK1の活性、mRNA量とも上昇していることから、βARK1は心不全におけるβ2受容体脱感作の中心的役割を担うと考えられている。したがってβARK1阻害剤は慢性心不全治療薬として期待される。

　βARK1を含むセリン/トレオニンリン酸化酵素は一般にATP結合部位と基質結合部位を有する。ATP結合部位は深いポケット状のアデニン結合部位等から構成され、この部位のアミノ酸残基およびリガンド認識機構は高度に保存されている。一方、基質結合部位はセリン/トレオニンリン酸化酵素間で差異が比較的大きく、一般に空間的に比較的広範囲にわたる複数の相互作用部位を通じて基質を認識する。加えて、現在までに得られているリン酸化酵素低分子阻害剤の多くがアデニン結合部位に結合すること、リン酸化酵素間で交叉阻害活性を示すことから、アデニン結合部位は低分子が高親和性を持ち得るもののリン酸化酵素間の選択性は持ちにくく、基質結合部位は選択性が期待されるものの低分子が高親和性を持ちにくいと推測される。βARK1もこの一般的な傾向をもつと仮定した場合、いずれか一方の結合部位との結合では高い親和性と選択性を両立し難いと予測される。そこで、アデニン結合部位および基質結合部位の双方に同時に相互作用する分子を獲得すれば選択性と高親和性を両立できると考えた。加えて、βARK1選択的な低分子阻害剤はいまだ報告されておらず、心不全治療の観点からも有用と考えた。したがって本研究ではβARK1のアデニン結合部位および基質結合部位の双方に注目し、この部位を阻害する分子を見出す理論的手法を考案し、この方法を用いて心不全治療薬を指向した阻害剤の獲得を目指した。

　本研究の阻害剤設計戦略に必須であるβARK1の立体構造は未知である。そこでホモロジーモデリング法を用いてβARK1立体構造モデルを構築することとした。まずβARK1とアミノ酸配列の相同性が高い立体構造既知タンパクを検索しPKAを見出した。複数あるPKA結晶構造解析のうち、基質類似ペプチド阻害剤PKI[5-24]が結合したPKAの構造を鋳型としてホモロジーモデリング法によりβARK1立体構造をモデリングした。

　つぎにPKAとPKI[5-24]の相互作用様式を分子力場により解析するとともに、各種ペプチドのPKAに対する親和性の報告例を参照し、PKA-PKI[5-24]相互作用を解析した。その結果、PKAは、s-11、s-6、s-3、s-2、s+1位で基質側鎖に特異的な認識を、s-7、s-2、s、s+1位で基質主鎖の認識を行っていると考えられた。つづいて対応するβARK1立体構造モデルの各部位をPKAと比較した。その結果、PKAのs-11、s-6、s-2、s+1位がそれぞれ疎水性、酸性、酸性、疎水性であるのに対しβARK1の対応する部位は親水性、中性、塩基性、親水性と異なる性質を有し両酵素は基質特異性が異なると予測された。一方、s-3位は両酵素とも酸性で静電的性質は共通するものの、アスパラギン酸とグルタミン酸の側鎖の差異をはじめとする立体的な差があった。

　そこで、予測した基質認識の差に基づき、βARK1選択的な阻害剤を獲得する方策を考察した。まず、βARK1選択的な阻害剤を設計する前提条件として、βARK1と類似性の高いPKAを阻害しないβARK1阻害剤は、βARK1との類似性がより低い他のリン酸化酵素を阻害する可能性も低いと仮定した。さらに、アデニン結合部位と基質結合部位の双方に結合するためには両部位間の距離は薬物分子として相応しい分子量の化合物が到達しえる範囲内にある必要があると考え、両部位間の距離を推測した。その結果、両酵素間で大きな差異があり選択性が期待されるs-11、s-6、s-2、s+1位はアデニン結合部位から比較的遠い一方、s-3位はアデニン結合部位に近く低分子で両結合部位を同時に阻害することは可能と考えられた。そこで以後s-3位に注目することとした。

　βARK1モデル構造の検証として、βARK1のs-3位が基質認識に関与している傍証を実験的に得る必要があると考えた。βARK1モデル構造のs-3位はAsp278、Ala321、Ile485から形成され、Asp278を疎水性、塩基性アミノ酸にするとs-3位全体の性質が変わると推測した。さらに変異型βARK1モデル構造を用いてこれを考察し、いずれの変異体もβ2受容体を認識できなくなると予測した。そこで実際に変異体を作成し、これらの仮説を検証することとした。Sf-9細胞で野生株と同じ条件で変異タンパクを生産しβ2受容体のリン酸化能を調べたところ、いずれの変異体もβ2受容体をリン酸化しなかった。この結果はモデル構造に基づく予測結果と一致することから、モデル構造の妥当性を支持する傍証となると考えた。

　既知の阻害剤とタンパクの複合体立体構造情報および構造活性相関情報から、アデニン結合部位は一般に芳香環と水素結合性原子を併せ持つ化合物を認識すると考えられる。そこで本研究でもこの条件を満たす低分子化合物を探すこととした。標的タンパクの立体構造情報に基づき理論的に阻害化合物を獲得する方法のひとつにバーチャルスクリーニング法がある。しかしながら芳香環と水素結合性原子を同時に検索式とするプログラムは入手できる範囲で報告されていない。そこで芳香環と水素結合性原子を同時に検索し、リガンドのフレキシビリティを考慮して標的タンパクとのドッキングを行うバーチャルスクリーニングプログラムARCHER(Automatic & Rational Complementary Hit-compound ExploreR)を作成した(図2)。さらにARCHERの動作検証として5種のタンパク-リガンド複合体構造をARCHERで予測した結果、結晶構造を概ね再現できた。したがってARCHERの動作が妥当であると結論した。

　ARCHERによるバーチャルスクリーニングは技術上の理由からアデニン結合部位のみを標的とするほうが計算効率が高い。そこで、第一段階としてARCHERによりアデニン結合部位に結合する化合物を絞り込み、第二段階としてs-3位に注目したPKAとの比較ドッキングスタディによりβARK1選択的阻害剤を選出した。

　まず標的とするβARK1モデル構造の精度不足を補うと同時に、アミノ酸側鎖の運動性を考慮するため、βARK1のアミノ酸側鎖に2種のコンフォマーを設定した。つぎに、他のリン酸化酵素とそれらのリガンドの相互作用を参照しながら、ARCHER入力用の検索式としてβARK1のアデニン結合部位を記述するファーマコフォアを構築した。つづいてARCHERによりバーチャルスクリーニングを実施した。検索対象としたAvailable Chemical Database(ACD、267、733化合物)に対し、まず2次元構造から3次元構造への変換、立体異性体の付加、分子量(200-650)による選別を行い、データベースを263、334化合物に絞り込んだ。つぎに化合物のフレキシビリティを考慮しながらファーマコフォアへの合致の可否を自動判定し112、314化合物に絞った。さらにファーマコフォアをβARK1モデル構造に置き換えて候補化合物構造をβARK1モデル構造に自動ドッキングし、評価エネルギー値の上位計4,000化合物から化学的に不安定な化合物を除いて3,680化合物とした。つづいて、ここまで得られた候補化合物-βARK1複合体モデル構造をグラフィクスディスプレー上で目視し、アデニン結合部位での水素結合、同部位での疎水相互作用、複合体形成時のコンフォメーション、の3点に注目しつつ類似骨格化合物を省き280化合物とした。

　第二段階として、280の候補化合物-βARK1複合体モデル構造にPKA結晶構造を重ね合わせ、PKAとの比較ドッキングスタディを実施した。比較に際しては、候補化合物とPKAのs-3位のGlu127側鎖、Thr51主鎖等との間で立体反発が起こるか否かに注目し、最終的に11化合物を候補として選出した(図3)。

　まずこれらのβARK1阻害活性を測定した結果、3化合物がβARK1をIC50 126-563μMで阻害した(表1)。一方、陰性対象として乱数的に選出した11化合物はいずれも1mMでβARK1を阻害しなかった。つぎにβARK1阻害活性を示した3化合物のPKA阻害活性を測定したところ、1mMでも阻害しなかった(表2)。以上より、これら3化合物がβARK1を選択的に阻害することが示された。これら3化合物のβARK1阻害作用はいまだ報告されておらず、したがって本結果は新規の知見である。

　以上まとめると、第一に、βARK1立体構造モデルを作成し、類似リン酸化酵素であるPKAとの比較に基づきAsp278が基質認識に重要であると予測し、変異株の作製と活性測定を通じてこれを実験的に証明した。第二に、水素結合部位および芳香環結合部位を認識する低分子化合物をデータベース中から検索するバーチャルスクリーニングソフトウェアARCHERを作製した。第三に、アデニン結合部位に注目してARCHERを用いて市販化合物からβARK1阻害剤を検索し、続いてs-3位に注目したPKAとの比較ドッキングスタディで候補化合物を選別し、βARK1選択的な阻害剤3化合物を見出した。

　本研究は、β2受容体の脱感作を担うβARK1を選択的に阻害する化合物を初めて見出した。これらは慢性心不全におけるβ2受容体脱感作を抑制するという新規治療法を検証する上で有用な研究ツールを提供するものと確信する。加えて、リン酸化酵素の選択的阻害化合物を理論的に獲得する方法を考案し実証した。本手法は数多くの疾患の治療薬標的である各種リン酸化酵素に対し選択的阻害剤を獲得する際に共通して貢献できるものであると考える。

図1 β2受容体に対するβARK1の働き

(a)アゴニストによりβ2受容体が活性化されるとβARK1がβ2受容体をリン酸化しGαの乖離とβ-arrestinのβ2受容体への結合が起こる (b)β-arrestinの仲介によりJNK活性化およびERK活性化が起こり後者はβ2受容体のinternalizationを起こす β2-AR:β2-adrenergic receptor, Gα:G-protein α-subunit, β:G-protein β-subunit, γ:G-protein γ-subunit,βARK1:β-adrenergic receptor kinase 1, P:phosphorylated residue, Src:src-family tyrosine kinase,JNK3:c-Jun N-terminal kinase 3, MAPKKK:mitogen-activated protein kinase kinasekinase,ERK:extracellular-regulated kinase

図2 ARCHERの動作概略

図3 データベース検索により選出したβARK1阻害候補11化合物

表1 βARK1阻害候補化合物のβARK1阻害活性およびβARK1との相互作用エネルギー予測値

表2 化合物4、6、10のPKA阻害活性

　慢性心不全は左心室の機能不全による心臓のポンプ機能の低下を伴う疾患である。心不全初期には交感神経系が活性化し心筋活動を促進して機能低下を補う。しかし慢性的な交感神経系の活性化は心筋細胞β2受容体を脱感作させる結果、応答性が低下し慢性心不全は悪化・伸展する。したがってβ2受容体の脱感作抑制は心不全治療法の候補と考えられている。脱感作には、β2受容体細胞内C末端リン酸化、受容体の発現量抑制、internalization等が関与する。β-Adrenergic kinase 1(βARK1)は活性化β2受容体を選択的にリン酸化して脱感作し、さらにこのリン酸化がβ2受容体のinternalization等にも関与する(図1)。さらにβARK1は心不全患者で活性、mRNA量が上昇していることからβ2受容体脱感作の中心的役割を担うとされる。したがってβARK1阻害剤は慢性心不全治療薬として期待されるものの、βARK1選択的な低分子阻害剤はいまだ報告されていない。

　βARK1を含むセリン/トレオニンリン酸化酵素は一般にATP結合部位と基質結合部位を有する。一般にアデニン結合部位は低分子が高親和性を持ち得るもののリン酸化酵素間の選択性は持ちにくく、基質結合部位は選択性が期待されるものの低分子が高親和性を持ちにくいと推測されている。本研究ではβARK1もこの傾向を示すと仮定し、アデニン結合部位および基質結合部位の双方に相互作用することにより選択性と高親和性を併せ持つβARK1阻害剤の獲得を目指している。本研究では阻害剤設計に必要なβARK1の立体構造が未知のため、まずβARK1とアミノ酸配列の相同性が高い立体構造既知タンパクを検索してPKAを見出し、複数あるPKA結晶構造解析のうち、基質類似ペプチド阻害剤PKI[5-24]が結合したPKAの構造を鋳型としてホモロジーモデリング法によりβARK1立体構造をモデリングしている。

　つぎにPKAとPKI[5-24]の相互作用様式を分子力場により解析するとともに、各種ペプチドのPKAに対する親和性の報告例を参照し、PKA-PKI[5-24]相互作用を解析したうえで、対応するβARK1立体構造モデルの各部位との間で比較を行っている。その結果として、PKAとβARK1の間で、s-11、s-6、s-2、s+1位は静電的性質が異なり、s-3位は静電的性質は類似するものの立体的な差があると推測している。さらに以上の各基質結合部位とアデニン結合部位の距離をモデル構造に基づき推測し、s-3位のみがアデニン結合部位に近く低分子で両結合部位を同時に阻害するのに好都合であると推測し、以後s-3位に注目している。

　まずβARK1モデル構造の検証としてβARK1のs-3位が基質認識に関与している傍証を実験的に得ている。すなわち、βARK1モデル構造のs-3位を形成するAsp278、Ala321、Ile485のうちAsp278をAlaまたはArgに変異したタンパクを作成しβ2受容体のリン酸化能を調べたところ、いずれの変異体もβ2受容体をリン酸化しなかったことから、モデル構造の妥当性を支持する傍証としている。

　既知の阻害剤とタンパクの複合体立体構造情報および構造活性相関情報から、一般にリン酸化酵素のアデニン結合部位は芳香環と水素結合性原子を併せ持つ化合物を認識するとされる。本研究でもこの条件を満たす低分子化合物を探すことを目指し、その手段として標的タンパクの立体構造情報に基づき理論的に阻害化合物を獲得するバーチャルスクリーニング法を選択している。ただし芳香環と水素結合性原子を同時に検索式とするプログラムが現状で報告されていないため、本研究では新規にバーチャルスクリーニングプログラムARCHER(Automatic & Rational ComplementaryHit-compound ExploreR)を作成している(図2)。さらにARCHERの動作検証として5種のタンパク-リガンド複合体の結晶構造をARCHERで概ね再現し、ARCHERの動作の妥当性を示している。

　化合物検索に際しては、技術上の理由からまずARCHERによってアデニン結合部位に結合する化合物を絞り込み、つぎにs-3位に注目したPKAとの比較ドッキングスタディによりβARK1選択的阻害剤を選出している。またβARK1のアミノ酸側鎖には2種のコンフォマーを設定し、モデル構造の精度不足を補いアミノ酸側鎖の運動性を考慮している。βARK1のアデニン結合部位を記述する検索式は他のリン酸化酵素とそれらのリガンドの相互作用を参照しながら設定している。

　バーチャルスクリーニングの手順として、検索対象のAvailable Chemical Database約27万化合物に対し、3次元構造の算出、立体異性体の付加、分子量による選別、ファーマコフォアへの合致判定、βARK1モデル構造へのドッキング、不安定化合物除去、相互作用様式の目視確認、類似骨格化合物除去を順に実施し280化合物を選出している。

　続いてこれらの候補化合物とβARK1の複合体モデル構造にPKA結晶構造を重ね合わせ、PKAとの比較ドッキングスタディを実施し、最終的に11化合物を選出している(図3)。

　さらに阻害活性測定実験により、11化合物中3化合物がIC50 126-563μMのβARK1阻害活性を有すること(表1)、これら3化合物は1mMでもPKAを阻害しないこと(表2)を確認し、これら3化合物がβARK1を選択的に阻害するという新規の知見を得ている。

　研究を総括すると、第一に、βARK1立体構造モデル構造および変異株の活性測定を通じ基質認識におけるAsp278の重要性を指摘している。第二に、水素結合部位および芳香環結合部位を同時に検索できるバーチャルスクリーニングソフトウェアARCHERを作製しその妥当性を既知の系で確認している。第三に、ARCHERを用いて市販化合物からβARK1阻害剤を検索し、PKAとの比較ドッキングスタディで候補化合物を選別し、βARK1選択的な阻害剤3化合物を見出している。

　本研究は、β2受容体の脱感作を担うβARK1を選択的に阻害する化合物を初めて見出しており、慢性心不全の新規治療法を検証する有用な研究ツールを提供するものといえる。加えて、本研究で考案・実証しているリン酸化酵素の選択的阻害化合物獲得法は、数多くの疾患の治療薬標的である各種リン酸化酵素に対し広く応用できるものと期待される。

　以上、飯野稔の研究成果は医薬化学、構造生物学に資するところ大であり、博士(薬学)の学位を授与するに十分なものと認めた。

図1 β2受容体に対するβARK1の働き

(a)アゴニストによりβ2受容体が活性化されるとβARK1がβ2受容体をリン酸化しGαの乖離とβ-arrestinのβ2受容体への結合が起こる (b)β-arrestinの仲介によりJNK活性化およびERK活性化が起こり後者はβ2受容体のinternalizationを起こす β2-AR:β2-adrenergic receptor, Gα:G-protein α-subunit, β:G-protein β-subunit, γ:G-protein γ-subunit,βARK1:β-adrenergic receptor kinase 1, P:phosphorylated residue, Src:src-family tyrosine kinase,JNK3:c-Jun N-terminal kinase 3, MAPKKK:mitogen-activated protein kinase kinase kinase,ERK:extracellular-regulated kinase

図2 ARCHERの動作概略

図3 データベース検索により選出されたβARK1阻害候補11化合物

表1 βARK1阻害候補化合物のβARK1阻害活性およびβARK1との相互作用エネルギー予測値

a 阻害値が負値の場合は0とした

表2 化合物4、6、10のPKA阻害活性

a 陽性対照