HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) は、後天性免疫不全症候群 (acquired immune deficiency syndrome : AIDS) の原因となるレトロウイルスである。HIV-1には、末梢血単核球 (PBMC) とマクロファージに親和性を示し、細胞合胞体形成能に乏しい型 (M-tropic、NSI型) と、PBMCとCD4陽性株化T細胞に親和性を示し、合胞体形成能の高い型 (T-tropic、SI型)、および両方に親和性をもつ dual tropic 型が存在する。このような細胞指向性の違いは、HIV-1が細胞侵入の際に使用するコレセプターの違いに起因しており、M-tropic 型は7回膜貫通型ケモカイン受容体のCCR5を、T-tropic 型は同じく7回膜貫通型ケモカイン受容体のCXCR4を使って吸着、侵入することから、それぞれのウイルスをR5型、X4型、また両者の中間の性質のものをR5/X4型とする分類が一般的になっている。HIV-1の細胞指向性やコレセプター使用能は、おもにウイルスの外被糖タンパク質 (Env gp120) のV3ループに生じるアミノ酸の変化、とりわけ陽電荷をもつアミノ酸の分布に伴って変化することが、欧米の主要な流行株であるサブタイプBのウイルスを用いた解析で示された。東南アジアに流行するCRF01_AE型ウイルスは、遺伝学的系統関係上異なるサブタイプに属し、V3ループのアミノ酸配列はサブタイプBと約50％の相違がある。CRF01_AE型ウイルスにもR5型、X4型やR5/X4型のウイルスが存在するが、それらの性質がサブタイプBと同様にV3ループによって規定されているかどうかは知られていない。ところが、CRF01_AEウイルスによる家族内感染例の解析において分離された、エイズ患者由来SI型ウイルス (NH1)、および無症候キャリアー由来NSI型ウイルス (NH2) のV3ループの配列を比較すると、SI型のV3ループには塩基性アミノ酸変異が蓄積して総電荷が増加していた。これはサブタイプBに類似した現象であり、これらのCRF01_AE型ウイルスにおいてもV3ループによってウイルスの性質が規定されていることが示唆された。そこで、CRF01_AE型HIV-1のV3ループ配列がウイルスのSI/NSI表現型やコレセプター使用能を規定する機能をもつかどうかを検討した。

CRF01_AE型でNSI型のNH2、およびSI型のNH1のV3ループ配列を、overlap extension法により、サブタイプB SI株LAIのDNAクローンの env gp120 V3ループ配列と置換し、組換えDNAクローンを作成した。この組換えDNAをHeLa細胞に遺伝子導入してウイルス粒子を調製した。組換えウイルス、LAI-NH1V3およびLAI-NH2V3のSI/NSI表現型、およびコレセプター使用能を、PBMC、CD4陽性株化T細胞MT2、およびCCR5またはCXCR4を発現するHOS-CD4細胞 (HOS-CD4-CCR5またはHOS-CD4-CXCR4) を用い、ウイルスを接種した培養上清の逆転写 (RT) 活性を測定して調べた。その結果、LAI-NH1V3ウイルスはSI型/X4型、LAI-NH2V3ウイルスはNSI型/R5型を示した。V3を組換えたウイルスの性質がV3ループの由来する親株のCRF01_AE型ウイルス (NH1とNH2) の性質と一致したことから、CRF01_AE型ウイルスのV3ループにもウイルスのSI/NSI表現型やR5/X4使用能を規定する能力があることが明らかになった。

NH1とNH2とでV3ループ配列を比較すると、SI/X4型株NH1では8、11、および18番目の座位が塩基性アミノ酸（アルギニン）に変異し、それに伴いV3ループの総電荷が増すだけでなく、CRF01_AE型のNSI型株に高度に保存されているN結合型糖鎖付加部位が消失している。そこで、NH1のV3ループ配列に見られるこれらの塩基性アミノ酸変異、およびN結合型糖鎖付加部位の欠損変異のうち、どの変異がウイルスのNSI/R5型からSI/R4型への変換に関与しているのかを解析した。

NH2のV3ループをもつ組み換え体LAI-NH2V3を鋳型として、overlap extension法により、SI株NH1に見られる8、11、18番目のアルギニン変異、およびN結合型糖鎖付加部位の欠損変異を、種々の組み合わせで導入し、8つの組換え変異ウイルスLAI-NH2V3mtl〜8を作成した。PBMC、HOS-CD4-CCR5またはHOS-CD4-CXCR4細胞、CD4陽性株化T細胞、およびマクロファージにおける増殖を、各培養上清の逆転写活性により測定し、各ウイルスのコレセプター使用能や細胞指向性を検討した。その結果、変異の導入に伴ってウイルスのHOS-CD4細胞における増殖能が変化した。

親株LAI-NH2V3はHOS-CD4-CCR5で増殖し、HOS-CD4-CXCR4では増殖しないが、

11番残基をアルギニンに置換したもの (mt3、5、7、8) はHOS-CD4-CCR5で増殖しなかった。

3つの座位のうち、2つがアルギニンに置換されたもの (mt5〜8)はHOS-CD4-CXCR4で増殖するようになった。

mt5〜8のうち、8番目の残基がアルギニンに置換されていないmt5は、mt6〜8よりHOS-CD4-CXCR4での増殖能が低減していた。

11番目の残基を、中性アミノ酸であるアラニンに置換して、V3ループの電荷を変えずにN結合型糖鎖付加部位を欠損させたmt1は、親株と比べてHOS-CD4-CCR5での増殖能が低かった。

また、PBMCでは、HOS-CD4-CCR5、HOS-CD4-CXCR4のどちらでも増殖しなかったmt3を除くすべてが増殖した。CD4陽性株化T細胞では、8番と11番目にアルギニンをもつmt7とmt8のみが増殖した。また、マクロファージでは、サブタイプBの代表的なM-tropicウイルスのひとつであるAD8のV3との組み換え体LAI-AD8V3を含むすべての組み換えウイルスが、増殖能をもたなかった。以上より、LAI-NH2V3の11番目の残基を塩基性アミノ酸に置換すると一様にHOS-CD4-CCR5での増殖能が消失することから、このアミノ酸残基がCCR5使用能に関与していることが示された。3つのアルギニン変異のうち、少なくとも2つが導入されるとCXCR4使用能が出現することから、CRF01_AE型のV3ループにおいても、電荷の上昇によってウイルスのR5型からX4型への変換が生じることが示唆された。一方、CD4陽性株化T細胞での増殖には、8番目と11番目の塩基性アミノ酸置換が必須であり、HOS-CD4細胞でX4型を示すこととT細胞指向性とは必ずしも一致しない。さらに、LAIのV3を組換えたウイルスは、M-tropic ウイルスに由来するV3との組換えであってもマクロファージで増殖せず、V3ループの置換によるCCR5使用能の付与だけではマクロファージ指向性は獲得されないことが示唆された。

CRF01_AE型ウイルスのV3ループに組み換えた組み換えウイルスのコレセプター使用能と細胞指向性

CRF01_AE型でNSI/R5型のウイルス、NH2のV3ループをもつ組み換えウイルスLAI-NH2V3に、SI/X4型NH1のV3ループにみられる変異を導入してLAI-NH2V3mt1〜8を作成した。各々に導入した変異の位置とアミノ酸残基（一文字表記）を太字で示した。対照株についてはウイルスのSI/NSI表現型とR5/X4使用能を標記した。

各組み換えウイルスのHOS-CD4-CCR5あるいはHOS-CD4-CXCR4細胞における増殖能をウイルスの感染力価 (TCID ; tissue culture infective doses) で示した。

各組み換えウイルスの、末梢血単核球 (PBMC)、CD4陽性株化T細胞、およびマクロファージにおける増殖能を＋（増殖能あり）、および-（増殖能なし）で示した。

本研究は、東南アジアのHIV-1流行を形成する主要株であるCRF01_AE型HIV-1において、ウイルスのエンベロープタンパクgp120 (env gp120) のV3領域と、ウイルスの細胞指向性やコレセプター使用能との相関を解析し、以下の結果を得た。

CRF01_AEのSI型HIV-1 (NH1)、およびNSI型 (NH2) のenv gp120 V3ループ配列を、サブタイプB SI型DNAクローンLAIのV3ループと置換して作製した組換えウイルス、LAI-NH1V3、およびLAI-NH2V3を用いた解析の結果、各ウイルスのコレセプター使用能と細胞指向牲がそれぞれのV3ループの由来する親株と一致したことから、CRF01_AE型のV3ループ配列は、サブタイプBと同様に、ウイルスの細胞指向性やコレセプター使用能を規定する能力を有することが明らかになった。

また、異なるサブタイプ間の相同性の低いV3配列の組み換えにもかかわらず、感染性のウイルスが得られたことから、この組み換えが、種々のHIVのV3領域の機能を解析するのに汎用可能な手法であることが示された。

CRF01_AE型のNSI/R5型V3をもつ組み換えウイルスLAI-NH2V3のV3ループ配列に、SI/X4型NH1のV3ループの8、11、および18番の座位に見られる塩基性アミノ酸変異、およびN-結合型糖鎖付加配列の欠損変異を導入してウイルスの細胞宿主域とコレセプター使用能との相関を解析し、以下の結果を得た。

3つの塩基性アミノ酸変異のうち、少なくとも2つが導入されると、HOS-CD4+細胞でCXCR4使用能が出現することから、V3ループの電荷の上昇によってウイルスのR5型からX4型への変換がおこることが明らかになった。

11番目の残基を塩基性アミノ酸に置換するとCCR5使用能が消失することから、この座位のアミノ酸残基がNH2V3のCCR5使用能を規定することが示された。

V3のＮ-結合型糖鎖は、CXCR4使用を阻害する一方、CCR5使用には有利に作用することが示唆された。

CD4+株化T細胞での増殖には、8番目と11番目の塩基性アミノ酸置換が必須であり、HOS-CD4+細胞でのCXCR4使用能と株化T細胞指向性とが必ずしも対応しないこと、および、マクロファージ指向性もまた、ウイルスのCCR5使用能のみでは付与されないことが示された。

以上、本論文は、東南アジア地域の主要なHIV-1流行株であるCRF01_AE型ウイルスにおいて、細胞指向性やコレセプター使用能がenv gp120 V3ループ領域によって規定され、とりわけV3領域の総電荷の変動、およびN-結合型糖鎖付加配列が関与していることを明らかにした。また、HIVが感染に至適な性質を保持している機構を、サブタイプを限定することなく解明する手がかりを得た。これは、種々のHIVの感染拡大や感染者の病態進行を把握、制御するうえで非常に意義深く、学位の授与に値するものと考えられる。