【序論】

　関節リウマチ（rheumatoid arthritis；RA）は、全身の関節に破壊性の慢性炎症を起こすことを特徴とする自己免疫疾患である。RAには過去の疫学研究より遺伝性が存在することが知られている。これまでに、RA関連遺伝子は候補遺伝子アプローチやマイクロサテライトマーカーを用いた罹患同胞対解析により解析されてきたが、HLA-DRβ1遺伝子以外にはRA関連遺伝子として確定的な結果が得られたものはなかった。その背景にはRAは複数の遺伝子座と環境要因が相互に作用を及ぼし合いながら発病を規定する多因子疾患であり、個々の遺伝子座の遺伝的寄与が大きくないことが考えられる。近年、ヒトゲノム配列の決定に伴い、一塩基多型（single nucleotide polymorphism；SNP）をゲノム上に正確に位置付け、遺伝マーカーとして用いることへの有用性が期待されている．SNPは1つの塩基が他の塩基に置き換わったタイプの多型であり、他の多型と比較して圧倒的に数が多く、ゲノム全域に比較的均一に分布していることが特徴である。さらに、SNPを正確で高速にタイピングする技術が開発されたことで体系的遺伝子多型解析を行う素地が整ってきた。本研究では、ゲノム上に高密度に存在するSNPを用い、遺伝的寄与の低い遺伝子座を検出することに適した解析法であるケース・コントロール関連解析を行い、RA関連遺伝子を探索・同定した。RA関連遺伝子を同定することはRAの病態解明につながり、予防・診断・治療法の開発に貢献すると考えられる。

【方法及び結果】

1．　5番染色体長腕5q31領域の連鎖不平衡分布の確認

　第5番染色体長腕5q31領域は、サイトカイン遺伝子などの免疫に関係する遺伝子がクラスターする領域である。また、クローン病や気管支喘息などの炎症性・自己免疫疾患に関連することも示唆されていることから、RAにおいても関連遺伝子の存在が期待された。そこで、5q31領域内のNT_007072.11（NCBI，build31）で示される2．3Mbの範囲を解析対象領域とし、日本人のSNPデータベース（JSNPデーターベース）より対象領域内に位置する172SNPsを抽出した。それらのSNPを非疾患群658検体用いてタイピングし、以下の3つの条件、1）タイピング成功率が90％を超える、2）マイナーアレル頻度が20％を超える、3）Hardy−Weinberg平衡検定p値が0.01を超えることを満たす、115SNPsを解析に用いるSNPとして採用した。次に、対象領域の連鎖不平衡（linkage disequilibrium；LD）の分布を解析するために、115SNPsすべての組み合わせによるpairwise LD index，Δを算出し、2次元にプロットした。その結果、本領域はΔ>0.5で判別すると6つのLDのブロック（block1−6）に分かれた（図1a，b）。

2．　ケース・コントロール関連解析

　まず、互いにLDの関係が強いSNPは、同じようなジェノタイプ分布を示すことが推測されることから、関連解析を効率化するために115SNPsをΔ値（Δ>0.97）によりグループ化した。結果、115SNPsのうち90SNPsが18のグループに分類された。各グループから1つ代表SNPを抽出し、ケース・コントロール解析を行った（疾患群：830検体，非疾患群：658検体）。その結果、劣性遺伝モデル形式による比較で、強い関連強度を示すSNPを検出した（slc2F1；x2値＝17．1，p＝0．000034）。Bonferroniの補正を代表18SNPsあるいは115SNPsで行っても、slc2F1は統計学的に有意であった。従って、slc2F1の位置するblock2の領域がRA関連領域であると考えた。

3．　RA関連領域block2の関連解析

　block2は約240kbの範囲に4つの既知遺伝子、PDZ and LIM domain protein 4 (RIL),solute carrier family 22,member 4(SLC22A4),SLC22A5,interferon regulatory factor 1(IRE1)を含む領域である。また、この範囲には115SNPs中38SNPsが位置し、うち32SNPsはグループに分類されている。どのグループにも分類されないSNPが6個存在したのでそれらのSNPについてケース・コントロール解析を行ったが、RAと関連は示唆されなかった。従って、block2のRAとの関連は、slc2F1と同じグループに分類されるSNPに由来するものと考えた。それらのSNPはSLC22A4,A5の遺伝子領域に分布していたことから、本領域のRA関連候補遺伝子をSLC22A4,A5の2遺伝子に絞った（図1c）。

4．　RA関連遺云子SLC22A4の同定

　SLC22A4,A5は、互いにアミノ酸配列で約76％の相同性をもつ有機カチオントランスポーターをコードする遺伝子である。RAとの関わりを推測するために、RAと関係する免疫系の組織・細胞を中心にヒトの組織発現分布を定量的RT-PCRにて解析した。SLC22A5mRNAは腎臓での発現が著しく高いこと、SLC22A4mRNAは腎臓でも発現するが、骨髄や末梢血でも発現量が高いことが分かった。また、SLC22A4は末梢血mononuclear細胞の中では、CD14陽性細胞で特に発現が高いことが分かった。さらに、RAの主病変部である滑膜組織由来の滑膜線維芽細胞では、炎症性の刺激であるTNFαで処理することにより、SLC22A4mRNA発現量は2倍程度上昇することが分かった。

　コラーゲン誘発関節炎マウス（CIAマウス）は、関節炎モデルマウスとして一般的に用いられている動物モデルである。病態モデルのマウスSlc22a4発現を解析するために、CIAマウスの肢切片を作製し、抗マウスSlc22a4抗体を用いて免疫染色した。結果、炎症が惹起されている関節部位の浸潤細胞に強い染色性が得られた。一方、抗マウスSlc22a5抗体による染色ではこのような染色性は得られなかった。また、正常マウスの関節には抗マウスSlc22a4抗体による染色性は観察されなかった。以上のことから、ヒト組織での発現分布とCIAモデルの発現解析から、RAとより関連が推測できるSLC22A4を本領域のRA関連遺伝子として結論付けた。

5． 責任SNPの探索

　SNPは遺伝子構造上の位置で分類され、それぞれの位置で表現型への影響が推測されている。アミノ酸変化を伴うSNP（cSNP）や発現調節領域に存在するSNP（rSNP）はそれ自体、タンパクの機能変化や発現量の変化をもたらすこと予想される。SLC22A4遺伝子領域内に直接RAと関連を示すSNP（責任SNP）が存在する可能性を検討した結果、cSNPが3個、5'flanking領域に3個のrSNPが存在したが、これらのSNPはRAとの関連が示唆されなかった。イントロン領域にも発現制御領域があることが考えられるため、イントロン1内のSNPを解析した結果、9SNPsがslc2F1と強いLDの関係にあることが分かった。それらのSNP周辺配列に結合する因子をTRANSFACデータベースによりSNPアレル別に推測したところ、slc2F2周辺配列ではC，Tアレルのうち、TアレルでRUNX1結合コンセンサス配列と100％の一致を示したが、Cアレルでは＜85％しか示さなかった。そこで、slc2F2周辺配列への結合をElectrophoreticl mobility shift assay（EMSA）にて解析した結果、slc2F2のC，Tアレルともに結合因子が存在するが、Tアレルの方が結合因子との結合度が高く、また、その結合因子は抗RUNX1抗体によるsupershift assayでRUNXIであることが分かった（図2）。さらに、slc2F2周辺配列の転写活性に与える影響をレポーターアッセイで検証した結果、T、Cアレル間で差が認められ、RA感受性Tアレルで転写活性が低いことが分かった（図3）。

6．　RUNX1遺伝子領域内SNPのケース・コントロール関連解析

　RUNX1は主に血球系の細胞に発現する転写因子であり、血球系細胞の分化・増殖に関与する。最近になり、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデスおよび乾癬の疾患関連遺伝子に関与すること報告されている。RUNX1遺伝子領域内のSNPについてもRAとの関連を評価した結果、RUNH1のイントロン6に存在するSNPがRAと関連を示すことが分かった（優性遺伝モデル形式：X2値＝12.76，p＝0.00035）。

【まとめと考察】

SNPによるケース・コントロール関連解析によりRA関連遺伝子SLC22A4を同定した。SLC22A4は免疫系組織、細胞に発現することを明らかにし、また、転写因子RUNX1結合配列に位置するRA関連SNPを見出した。SLC22A4のSNPに認められたRAとの関連と、そのSNPがRUNX1の結合と転写活性に与える影響から、SLC22A4の発現量の低下がRAへの罹患しやすさをもたらすと推測された。さらに、RUNX1もRA関連遺伝子であることを示した。これらの結果は、複数の遺伝子が相互作用を及ぼしあいながら発症に至るRAの遺伝的側面を考察する上で意義深い。

今後は、RAと関連が示唆されたSLC22A4とRA病態への関連を明確にしていくことともに、RAと関連が示された遺伝子群の機能的、遺伝的相互作用を解析していくことが疾患の病態解明と予防、診断および治療などの臨床への応用に役立つことを期待される。

図2 　RA関連SNP slc2F2周辺配列に結合する因子（EMSA）

図1　NT_007072.11の連鎖不平衡の分布

a. pair wise LD index，Δのプロット図とLDブロック

b. 遺伝子地図とLDブロック

c．RA関連領域（block2）の拡大図。・はRA関連SNPと強いLDの関係にあるSNPを示す

図3 RA関連SNPslc2F2周辺配列が転写活性に与える影響

a．コンストラクト図

b．レポーターアッセイ結果

　関節リウマチ（rheumatoid arthritis；RA） は、全身の関節に破壊性の慢性炎症を起こすことを特徴とする自己免疫疾患である。RA には過去の疫学研究より遺伝性が存在することが知られている。これまでに、RA 関連遺伝子は候補遺伝子アプローチやマイクロサテライトマーカーを用いた罹患同胞対解析により解析されてきたが、HLA-DRB1 遺伝子以外にはRA 関連遺伝子として確定的な結果が得られたものはなかった。その背景にはRA は複数の遺伝子座と環境要因が相互に作用を及ぼし合いながら発病を規定する多因子疾患であり、個々の遺伝子座の遺伝的寄与が大きくないことが考えられる。近年、ヒトゲノム配列の決定に伴い、一塩基多型（single nucleotide polymorphism ; SNP） をゲノム上に正確に位置付け、遺伝マーカーとして用いることへの有用性が期待されている．SNP は1 つの塩基が他の塩基に置き換わったタイプの多型であり、他の多型と比較して圧倒的に数が多く、ゲノム全域に比較的均一に分布していることが特徴である。さらに、SNP を正確で高速にタイピングする技術が開発されたことで体系的遺伝子多型解析を行う素地が整ってきた。本研究において、申請者は、ゲノム上に高密度に存在するSNP を用い、遺伝的寄与の低い遺伝子座を検出することに適した解析法であるケース・コントロール関連解析を行い、RA 関連遺伝子を探索・同定した。

1. 　第5 番染色体長腕5q31 領域の連鎖不平衡分布の確認

　第5 番染色体長腕5q31 領域は、 サイトカイン遺伝子などの免疫に関係する遺伝子がクラスターする領域である。また、 クローン病や気管支喘息などの炎症性・自己免疫疾患に関連することも示唆されていることから、RA においても関連遺伝子の存在が期待された。そこで、5q31 領域内のNT_007072.11(NCBI, build31) で示される2.3Mb の範囲を解析対象領域とし、日本人のSNP データベース(JSNP データ−ベース)より対象領域内に位置する172 SNPs を抽出した。それらのSNP を非疾患群658 検体用いてタイピングし、以下の3 つの条件、1) タイピング成功率が90％ を超える、2) マイナーアレル頻度が20% を超える、3) Hardy-Weinberg 平衡検定p 値が0.01 を超えることを満たす、115 SNPs を解析に用いるSNP として採用した。次に、対象領域の連鎖不平衡（linkage disequilibrium; LD） の分布を解析するために、115 SNPs すべての組み合わせによるpairwise LD index, Δ を算出し、2 次元にプロットした。その結果、 本領域はΔ > 0.5 で判別すると6 つのLD のブロック（block 1−6） に分かれた。

2. 　ケース・コントロール関連解析

　まず、互いにLD の関係が強いSNP は、 同じようなジェノタイプ分布を示すことが推測されることから、関連解析を効率化するために115 SNPs をΔ 値(Δ >0.97) によりグループ化した。結果、115 SNPs のうち90 SNPs が18 のグループに分類された。各グループから1 つ代表SNP を抽出し、 ケース・コントロール解析を行った（ 疾患群：830 検体， 非疾患群：658 検体）。その結果、 劣性遺伝モデル形式による比較で、 強い関連強度を示すSNP を検出した(slc2F1；χ2 値＝17.1，p＝0.000034) 。Bonferroni の補正を代表18 SNPs あるいは115 SNPs で行っても、slc2F1 は統計学的に有意であった。このことから申請者はslc2F1 の位置するblock 2 の領域がRA 関連領域であると考えた。

3.　 RA 関連領域block 2 の関連解析

　block 2 は約240kb の範囲に4 つの既知遺伝子、PDZ and LIM domain protein 4 (RIL)，solute carrier family 22, member 4 (SLC22A4)，SLC22A5，interferon regulatory factor 1(IRF1) を含む領域である。また、この範囲には115 SNPs 中38 SNPs が位置し、 うち32 SNPs はグループに分類されている。どのグループにも分類されないSNP が6 個存在したのでそれらのSNP についてケース・コントロール解析を行ったが、RA と関連は示唆されなかった。従って、block 2 のRA との関連は、slc2F1 と同じグループに分類されるSNP に由来するものと申請者は考えた。それらのSNP はSLC22A4，A5 の遺伝子領域に分布していたことから、本領域のRA 関連候補遺伝子をSLC22A4,A5 の2 遺伝子に絞った。

4. 　RA 関連遺伝子SLC22A4 の同定

　SLC22A4，A5 は、互いにアミノ酸配列で約76% の相同性をもつ有機カチオントランスポーターをコードする遺伝子である。RA との関わりを推測するために、RA と関係する免疫系の組織・細胞を中心にヒトの組織発現分布を定量的RT-PCR にて解析した。SLC22A5 mRNA は腎臓での発現が著しく高いこと、SLC22A4 mRNA は腎臓でも発現するが、骨髄や末梢血でも発現量が高いことが分かった。また、SLC22A4 は末梢血mononuclear 細胞の中では、CD14 陽性細胞で特に発現が高いことが分かった。さらに、RA の主病変部である滑膜組織由来の滑膜線維芽細胞では、炎症性の刺激であるTNFα で処理することにより、SLC22A4 mRNA 発現量は2 倍程度上昇することが分かった。

　コラーゲン誘発関節炎マウス(CIA マウス)は、 関節炎モデルマウスとして一般的に用いられている動物モデルである。病態モデルのマウスSlc22a4 発現を解析するために、CIA マウスの肢切片を作製し、抗マウスSlc22a4 抗体を用いて免疫染色すると、炎症が惹起されている関節部位の浸潤細胞に強い染色性が得られた。一方、抗マウスSlc22a5 抗体による染色ではこのような染色性は得られなかった。また、正常マウスの関節には抗マウスSlc22a4 抗体による染色性は観察されなかった。ヒト組織での発現分布とCIA モデルの発現解析から、申請者はRA とより関連が推測できるSLC22A4 を本領域のRA 関連遺伝子として結論付けた。

5. 　責任SNP の探索

　申請者はSLC22A4 遺伝子領域内に直接RA と関連を示すSNP（ 責任SNP） が存在する可能性を検討し、cSNP が3 個、5' flanking 領域に3 個のrSNP を見出したが、これらのSNP はRA との関連が示唆されなかった。イントロン領域にも発現制御領域があることが考えられるため、イントロン1 内のSNP を解析した結果、9 SNPs がslc2F1 と強いLD の関係にあることが分かった。それらのSNP 周辺配列に結合する因子をTRANSFAC データベースによりSNP アレル別に推測したところ、slc2F2 周辺配列ではC，T アレルのうち、T アレルでRUNX1 結合コンセンサス配列と100% の一致を示したが、C アレルでは< 85％ しか示さなかった。そこで、slc2F2 周辺配列への結合をElectrophoretic mobility shift assay (EMSA) にて解析した結果、slc2F2 のC, T アレルともに結合因子が存在するが、T アレルの方が結合因子との結合度が高く、また、その結合因子は抗RUNX1 抗体によるsupershift assay でRUNX1 であることが分かった。さらに、slc2F2 周辺配列の転写活性に与える影響をレポーターアッセイで検証した結果、T、C アレル間で差が認められ、RA 感受性T アレルで転写活性が低いことが分かった。

6. 　RUNX1 遺伝子領域内SNP のケース・コントロール関連解析

　RUNX1 は主に血球系の細胞に発現する転写因子であり、血球系細胞の分化・増殖に関与する。最近、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデスおよび乾癬の疾患関連遺伝子としても報告されている。RUNX1 遺伝子領域内のSNP についてもRA との関連を評価した結果、RUNX1 のイントロン6 に存在するSNP がRA と関連を示すことが分かった（ 優性遺伝モデル形式：χ2 値＝12.76，p＝0.00035）。

　このように申請者はSNP によるケース・コントロール関連解析によりRA 関連遺伝子SLC22A4 を同定した。SLC22A4 は免疫系組織、細胞に発現することを明らかにし、また、転写因子RUNX1 結合配列に位置するRA 関連SNP を見出した。SLC22A4 のSNP に認められたRA との関連と、そのSNP がRUNX1 の結合と転写活性に与える影響から、SLC22A4 の発現量の低下がRA への罹患しやすさをもたらすと推測した。さらに、RUNX1 もRA 関連遺伝子であることを示した。これらの結果は、複数の遺伝子が相互作用を及ぼしあいながら発症に至るRA の遺伝的側面を考察する上で有意義と考えられる。

　以上の如く本研究は慢性関節リウマチの遺伝学的危険因子に新たな知見を加えるものであり、本症の発症機序解明ならびに新規治療法開発・創薬に貢献するところが極めて大きく、博士（ 薬学） の学位に値するものと考える。