ミトコンドリアはグルコースやその他代謝を介してインスリン分泌作用を発揮する多くの分泌刺激の生化学的反応を中心的に司る細胞内小器官であることから,かねてよりインスリン分泌に関する研究領域において最も興味を惹かれる対象の一つであった。インスリンを分泌させる過程でミトコンドリアが枢要な働きを担うという概念は,ATP感受性K+ チャネル(KATPチャネル)のクローニングによってより具体的なものとなった。これはすなわち,インスリン分泌に重要と考えられその産生の大半をミトコンドリアに依拠するATPによってKATPチャネルが制御されていることが,実際に明確になったからである。インスリン分泌におけるミトコンドリアの重要性は,全糖尿病患者数の約1%を占めると推定されているミトコンドリアDNAの変異によって生ずる糖尿病のある種の型が明らかになったことによって,さらに明確なものとなっている。

私は,DNAやRNAの合成阻害薬であり,染色体外のDNAにおいてとくに強くこの作用が発揮される-すなわち,動物種由来の真核細胞ではミトコンドリアDNAにおいてこの作用が強く現れる-ethidium bromide(EtBr)をマウス由来の膵β細胞株であるβHC9細胞に比較的低濃度(0.4 μg/ml)で作用させることにより,ミトコンドリアDNAの転写を約90%抑制し,その結果グルコース応答性インスリン分泌に抑制をみるという結果を1998年に共同研究により得て報告している。同様の結果は他のグループからも報告されているが,これらの変化をきたす全体の機構については不明であり,とくに細胞内代謝の観点からは全く未解明であった。

ミトコンドリアDNAは電子伝達系を構成するの大半の複合体(複合体I,III,IV,V)のサブユニット(の一部)と,ミトコンドリア内においてこれらサブユニットの生合成に働くtransfer RNA分子とを特異的にコードしている。本論文では,EtBrによるミトコンドリアDNAの転写抑制が惹起する基質代謝の変化と,これによる刺激-分泌連関への影響を詳細に分析し,このようなミトコンドリアDNAの転写抑制下では乳酸の産生亢進を伴う嫌気性代謝の促進といった代謝の変化が生じることを見いだした。本論文の観察結果は,膵β細胞からのインスリン分泌に対してトコンドリア機能が有する生理的役割に対してのみならず,ミトコンドリアDNA異常に由来し,ミトコンドリアの機能低下に起因するミトコンドリア糖尿病をはじめとする諸疾患の発症病理やミトコンドリア糖尿病の臨床に対しても重要な洞察を与えるものである。

1)電子伝達系伝達系の抑制

この研究において私は,マウス由来の膵β細胞株であるβHC9細胞をEtBrとともに培養することにより,電子伝達系とインスリン分泌の関係を解析し,また,そのときの代謝の変化を詳細に検討した。私たちの従来の検討では,βHC9細胞を0.4 μg/mlのEtBrとともに4~6日間培養することにより,ミトコンドリアDNAの転写に約90%の減少が認められた。この減少した転写レベルは,ミトコンドリアの電子伝達系の機能低下をきたし,ミトコンドリアにおけるATP合成の消失を招来すると推測される。なぜなら,ミトコンドリアDNAは電子伝達系を構成する呼吸鎖複合体I,III,IV,V(複合体V:ATP synthase)のサブユニット(の一部)と,ミトコンドリア内においてこれらサブユニットの生合成に働くtransfer RNA分子とをコードしているからである。ここにおいて,ミトコンドリアDNAによってコードされるtransfer RNAは,これらミトコンドリアDNA自身によってコードされる呼吸鎖コンポーネントの生合成にのみ用いられることを指摘しておくことは重要であろう。

事実,私の今回の一連の実験において,グルコース刺激後に対照のβHC9細胞では認められたATP/ADP比の増加は,EtBrとともに4~6日間培養することにより低減した。

2)EtBr処理によるインスリン分泌の変化

したがって私は,電子伝達系の抑制がグルコースからのATP産生を低下させ,細胞膜電位の形成を阻害することにより,[Ca2+]iの上昇を小さくし,最終的にグルコース応答性インスリン分泌を消失させたものと推測した。実際,グルコース応答性インスリン分泌はβHC9細胞をEtBrとともに培養することにより急速に失われた。グルコースによる細胞膜の脱分極と[Ca2+]iの増加もこのEtBr処理により抑制されたが,glibenclamideによる変化は存続した。

インスリン分泌の濃度-分泌相関の検討でも,EtBr処理によるグルコース応答性ンスリン分泌の減少が認められた。これらの結果は,細胞膜脱分極と[Ca2+]i増加を介して惹起されるグルコースのインスリン分泌刺激作用にはミトコンドリア代謝が必要であることを示している。興味深いことに,βHC9細胞の特徴である2相性分泌の第1相と持続性の第2相は,EtBr処理によってともに減少していた。観察されたEtBr群における細胞内インスリン含量の対照群との比較のうえでの増加の少なくとも一部は,培養液が高濃度(25 mM)のグルコースを含むことに鑑みれば,このようなグルコース応答性インスリン分泌の減少によって説明されるであろう。加えて,グルコースによるインスリン合成の転写後調節による産生増加の機序も示唆されよう。

3)EtBr処理βHC9細胞のミトコンドリアにおける代謝の変化

EtBrによって惹起されるグルコース代謝の変化に関しては以下のようであった。すなわち,解糖系におけるグルコース代謝量に対応するグルコース利用は,EtBrとの4日間ないし6日間の培養によって,対照細胞に比較してごくわずかに減少したのみであった。これとは対照的に,TCA(tricarboxylic acid)回路の代謝の流れを示すグルコース酸化は著明に低下しEtBr処理6日ではほぼ消失した。このことはEtBrによる処理は電子伝達系を抑制するのみならずTCA回路を間接的に阻害し,その回転をも弱めていることを示す。では,電子伝達系自身とは直接にリンクしていないTCA回路の代謝回転がなぜ低減するのであろうか。

私はこの低減が,電子伝達系の抑制によってもたらされるミトコンドリア内のNADHの蓄積に起因するのではないかと考えた。電子伝達系の最初の段階(複合体I:NADH脱水素酵素)でNADHをNADに変換する電子伝達系をEtBrによって抑制すると,ミトコンドリア内のNADH濃度は上昇し,上昇したNADHがNADH-NAD反応に共役したTCA回路のステップを阻害することにより,逆行性にTCA回路の代謝回転を減弱せしめ,これによって最終的にTCA回路におけるCO2の産生も低下させるものと考えられる。この仮説を検証するために,私は,非常に微弱であるために2光子励起レーザー顕微鏡によってのみ可能であったβHC9細胞の自家蛍光を測定し,細胞内のNADH濃度を評価したところ,実際にこれが増加していることを確認した。

4)EtBr処理βHC9細胞においてミトコンドリア電子伝達系の抑制によって生ずる細胞質の嫌気性代謝

ミトコンドリアにおいて増加したNADH,およびflavin補酵素の非平衡状態は,逆行性に,インスリン分泌に必須であるNADHシャトル機構を機能的に停止させ,その結果,ミトコンドリア内のNADHの増加は細胞質へと伝播するはずである。細胞質におけるこのNADHの増加が,細胞質においてNADHからNADへの反応と共役しているピルビン酸から乳酸への反応を促進し,乳酸の産生を促すことが想定される。実際,EtBr処理4日および6日において,乳酸の産生は著明に増強し,嫌気性代謝が促進していることを示していた。ミトコンドリア糖尿病患者の血中における乳酸の増加も,患者の筋肉ほかの組織に存在する同様の機構によって説明可能ではないかと考えられる。

5)まとめ

EtBrとともに培養したβHC9細胞において,[1]電子伝達系の転写の抑制によりNADH濃度とATP産生の低下が認められ,[2]NADHの蓄積によりTCA回路の代謝回転の減弱とCO2の産生低下が観察された。一方,[3]乳酸の産生亢進にみられるように,嫌気性代謝が増強していた。

EtBr処理βHC9細胞において,グルコース応答性インスリン分泌が短期間のうちに減少,消失したことから,電子伝達系を構成する呼吸鎖複合体のコンポーネントとこれらコンポーネントの生合成に働くtransfer RNA分子とをコードしているミトコンドリアDNAの転写抑制によって,ATP生合成とNADHのNADへの変換が低下していることが予想された。しかし,ミトコンドリアのその他の部分は,核DNAがコードする蛋白によって構成されていることから,保たれていると考えられる。この点でここに呈示した系は,ミトコンドリアDNAの変異によってミトコンドリアのtransfer RNAや電子伝達系のコンポーネントが障害されているミトコンドリア糖尿病の膵島のよい病態モデルであると考えられる。

この研究は電子伝達系とTCA回路の代謝の変化の関係を示したはじめてのものであり,この系は,インスリン分泌におけるミトコンドリア機能の生理的重要性への洞察を与えるのみならず,例えば日本においては数万人が罹患している可能性のあるミトコンドリア糖尿病のよい病態モデルとして機能しうるであろう。

本研究は、核酸合成阻害薬であり,染色体外のDNAにおいてとくに強くこの作用が発揮される(動物種由来の真核細胞ではミトコンドリアDNAにおいてこの作用が強く現れる)ethidium bromide(以下EtBr)をマウス由来の膵β細胞株であるβHC9細胞に比較的低濃度で作用させて,ミトコンドリアDNAの転写を抑制することにより招来されるグルコース応答性インスリン分泌の抑制機構を,とくに細胞内代謝の観点から解明したものであり、下記の結果を得ている。

1.電子伝達系の転写の抑制によりNADH濃度とATP産生の低下が認められた。

2.NADHの蓄積によりTCA回路の代謝回転の減弱とこれによるCO2の産生低下(グルコース酸化の低下)が観察された。

3.一方,乳酸の産生亢進にみられるように,嫌気性代謝は増強していた。

本論文で呈示した系は,ミトコンドリアDNAの変異によってミトコンドリアのtransfer RNAや電子伝達系のコンポーネントが障害されているミトコンドリア糖尿病の膵島のよい病態モデルであると考えられる。さらに,この研究は電子伝達系とTCA回路の代謝の変化の関係を示したはじめてのものであり,これは非常に微弱なβHC9細胞のNADH自家蛍光を2光子励起レーザー顕微鏡によって測定することによってはじめて可能となった。EtBr処理を行ったインスリン分泌細胞株によるこの系は,インスリン分泌におけるミトコンドリア機能の生理的重要性への洞察を与えるのみならず,例えば日本においては数万人が罹患している可能性のあるミトコンドリア糖尿病のよい病態モデルとしても機能しうるであろう。

以上、本論文はグルコース応答性インスリン分泌機構とミトコンドリア機能との関係を,とくに細胞内代謝の観点から解明したものであり、今後のインスリン分泌研究および糖尿病研究に重要な貢献をなすものであり、学位の授与に値する。