序論

血液脳関門は血液から脳内への物質移行を制限し、脳の恒常性を維持する上で重要な役割を担っている。血液脳関門の実体は脳毛細血管内皮細胞であり、細胞間に形成されている高度に発達したtight junctionによる拡散バリアと、管腔側細胞膜に発現するP-gpやBcrpによる能動的くみ出しを特徴とする。さらに有機アニオントランスポーターOatp1a4やOat3は脳毛細血管の脳側細胞膜に発現し、アニオン性薬物の脳実質内からの排泄を促進することが示唆されている。これら血液脳関門に発現する薬物輸送機構は医薬品の脳内濃度の決定に重要な役割を果たしており、その分子実体を解明することで医薬品の脳送達の実現に貢献したり、薬物間相互作用や遺伝的要因によるトランスポーター機能変動に起因する薬剤応答性の個人差の解明により医薬品適正使用に貢献したりする。本研究では、血液脳関門に発現するトランスポーターに注目し、抗インフルエンザ薬oseltamivirおよびその活性体であるRo64-0802の排出輸送機構ならびに有機アニオントランスポーターOatp1a4の役割を解明するため、ノックアウトマウスを用いたin vivo/in situ試験を実施した。

1.血液脳関門におけるoseltamivirと活性体Ro64-0802の能動的排出輸送機構の解析

oseltamivir服用後の異常行動による転落死が報道されたことを発端として、服用と異常行動との因果関係は国民的関心事となったが、まだ結論に至っていない。そこでoseltamivir及びRo64-0802の血液脳関門透過性および脳内暴露の支配要因となる排出輸送機構について検討した。

マウスにoseltamivirを静脈内投与した後、その脳内薬物量は脳毛細血管容積中の薬物量より十分に大きいことから、oseltamivirは血液脳関門を透過し、中枢神経系へ移行する。Mdr1a/1b-/-マウスではoseltamivirの脳-血漿濃度比の有意な上昇が認められ、Bcrp-/-マウスにおける脳-血漿濃度比は野性型マウスと同程度であった。すなわち、oseltamivirは血液脳関門においてP-gpによるくみ出しを受けることが明らかとなった。一方Mdr1a/1b-/-マウス及びBcrp-/-マウスにおいても、Ro64-0802の脳-血漿濃度比は野性型マウスと同程度であり、Ro64-0802の脳分布の低さはこれらトランスポーターによるくみ出しによるものではない。oseltamivirによる有害事象は若年齢層での報告例が多いとされていることから、Wistarラットの脳におけるP-gp発現量およびoseltamivirの脳分布に関する加齢依存性を検討した。成体ラットに比べて幼若ラットでは、P-gpのmRNAレベル量及びタンパク量ともに低く、それに伴いoseltamivirの脳-血漿濃度比は有意に高いことを明らかにした。

Usamiらはラット海馬スライスにおいてoseltamivir及びRo64-0802による異常発火が起こることを示しているが、Ro64-0802の方がより発火作用が強いことを見出している。Oat3は脳毛細血管内皮細胞の脳側細胞膜に局在し、脳実質内からの異物排泄に働くことが示唆されており、またRo64-0802はその基質となる。そこで、Oat3によるくみ出しがRo64-0802の脳分布を制限している要因である可能性について検討した。野生型マウスおよびOat3-/-マウスにおけるRo64-0802の脳内からの排出速度を比較したところ、Oat3-/マウスでは、大脳皮質からのRo64-0802消失は遅延しており、Ro64-0802はOat3によるくみ出しを受けることが明らかとなった。しかし、Oat3-/-マウスにおいても、24時間連続皮下投与後のRo64-0802の脳分布容積は脳毛細血管容積程度であった。この結果を説明する要因として、P-gpやBcrp以外の排出トランスポーターによる血液側でのくみ出しを仮定した。近年、新たに血液脳関門に発現していることが見いだされたABCトランスポーターMrp4についてRo64-0802の脳移行に及ぼす効果を検討した。oseltamivirを2時間連続静脈内投与した後のRo64-0802の脳-血漿濃度比は、Mrp4-/-マウスの方がわずかながら高く、さらに24時間連続皮下投与することで、野生型マウスとの差はより顕著となった。また、Ro64-0802自身を24時間連続皮下投与した後の脳-血漿濃度比も同様の結果であった。野生型マウスおよびMrp4-/-マウスにおけるRo64-0802の脳内からの排出速度の比較を行ったところ、Mrp4-/-マウスにおいてRo64-0802の脳からの排出が有意に遅延することが認められた。

以上の結果から、oseltamivirは血液脳関門を透過するが、P-gpによる能動的なくみ出しを受け中枢移行性が制限されていること、そして幼若ラットでは血液脳関門におけるP-gpの発現量は成体ラットに比べて低いため、oseltamivirの脳移行性が高いことを明らかとした。また、Ro64-0802も血液脳関門を透過することが可能だが、その脳分布はOat3とMrp4で形成されるベクトル輸送による制限を受け、見かけ上脳に分布しないことを明らかとした。

2.血液脳関門における有機アニオントランスポーターOatp1a4の機能評価

OATP1A2はヒトOATPファミリーから初めてクローニングされたトランスポーターであり、脳において豊富に発現し、血液脳関門への発現も認められることから、薬物輸送に関わっていると考えられている。Oatp1a4はヒトOATP1A2のげっ歯類ホモログであり、肝臓の他、脳や脈絡叢に発現している基質多選択的有機アニオントランスポーターである。βアミロイドを過剰産生する遺伝子改変動物では、アニオン性医薬品であるスタチンやサルタンの投与は、βアミロイド蓄積ないしβアミロイドによる神経症状を軽減することが報告されている。一般的にアニオン性化合物の膜透過性は小さいことから、こうした薬物の中枢神経系の移行にはトランスポーターの関与が想定されている。そこで、血液脳関門におけるOatp1a4がアニオン性薬物の中枢移行に関わるトランスポーターの分子実体であると考え、Oatp1a4-/-マウスを用いた薬物動態試験を行った。

免疫染色による解析の結果、Oatp1a4はマウス血液脳関門に発現し、脳毛細血管内皮細胞の脳側・血液側の両細胞膜に局在する。安定発現系を用いたin vitro輸送実験により基質選択性を解析した結果、マウスOatp1a4はpitavastatinをはじめとするアニオン性医薬品やdigoxinを基質とする。Oatp1a4-/-マウスを用いて、種々アニオン性薬物の脳内からの排出速度を比較したところ、野生型マウスに比べて、Oatp1a4-/-マウスではpitavastatin、rosuvastatin、pravastatin及びtaurocholateの消失は遅延し、これら化合物の脳内から血液方向への排出輸送は主にOatp1a4で説明することができる。さらに、in situ脳灌流法により取り込みクリアランスを測定したところ、pitavastatin、rosuvastatin、taurocholate及びochratoxin Aの取り込みクリアランスはOatp1a4-/-マウスにおいて有意に低下したことから、それら化合物の血液から脳への輸送にはOatp1a4が関与している。すなわちOatp1a4は脳内からの排出および血液中からの取り込みの両輸送過程に働く。一方、digoxinとDPDPEはOatp1a4基質であるにも関わらず、脳移行に対するOatp1a4の関与は認められなかった。これら薬物はP-gp基質となることから、野生型マウス及びOatp1a4-/-マウスに、P-gp阻害剤GF120918を静注した後、in situ脳灌流法により、[3H]digoxinの取り込みクリアランスを比較した。GF120918投与群ではdigoxinの取り込みクリアランスは顕著に増加した。GF120918投与群では、Oatp1a4-/マウスにおけるdigoxinの取り込みクリアランスは野生型マウスに比べて有意に低く、P-gp阻害時ではOatp1a4を介した輸送が認められた。

以上の結果から、Oatp1a4は種々の化合物の脳内から血液の排出、血液から脳への輸送に関与していることが明らかとなった。また、digoxinでは、Oatp1a4基質であっても、P-gpによる汲み出しを受けるため、血液脳関門透過性が制限されていることが明らかとなった。

結論

本研究により、oseltamivirの脳分布はP-gpによる制限を受け、Ro64-0802の脳分布はOat3とMrp4で形成されるベクトル輸送による制限を受けていることを明らかとした。これらトランスポーターの遺伝子多型や加齢に伴う輸送活性及び発現の変動が、oseltamivir及びRo64-0802の脳分布を変動させ、有害作用の発現と関連する可能性が考えられる。

また、Oatp1a4がアニオン性薬物の脳側からの排泄、血液から脳への輸送に関与していることを明らかとした。ヒトホモログOATP1A2は脳毛細血管の管腔側に発現していることから、医薬品の脳内への取り込みに働き、薬効の増強あるいは中枢性の副作用の回避等、創薬への応用が期待される。

医薬品の中枢応答性は脳内の標的分子近傍の濃度によって決定される。血液と中枢神経系との間には血液脳関門が存在し、医薬品の自由な拡散が制限されているため、血液脳関門透過性は中枢応答性を決定する重要な要因である。血液脳関門は拡散バリアとして機能するだけではなく、P-glycoprotein (P-gp/MDR1)やBCRP/ABCG2など異物排泄トランスポーターによる能動的な汲み出しにより能動的バリアとしても機能する。そのため薬物の血液脳関門透過性は排出トランスポーターの基質選択性も考慮する必要があり、中枢薬の開発を困難にしている要因となっている。トランスポーターにより、中枢神経系の移行が抑制されている場合、併用薬あるいは遺伝的要因に伴うトランスポーター機能の個人差は、薬剤応答性の個人差にも繋がる。創薬の観点からだけではなく、市販後での適性使用においても、対象薬物の血液脳関門透過機構を明らかにすることは重要な研究課題である。本研究では、申請者は抗インフルエンザ薬oseltamivirおよびその活性体であるRo64-0802に注目し、血液脳関門における排出輸送機構(Part-I)、ならびに有機アニオントランスポーターOatp1a4の薬物輸送における役割 (Part-II)を解明した。

Part-Iでは、oseltamivirに注目した試験が行われた。疫学調査では最終的に結論づけるに至らなかったが、インフルエンザ患者において、oseltamivir服用と異常行動との因果関係が一部で示唆されたことを鑑み、oseltamivirとその活性体Ro64-0802が血液脳関門を透過し、中枢神経系に到達するのか、ラットならびにマウスを用いて検討した。マウスにoseltamivirを静脈内投与した後の脳内薬物量は、脳毛細血管容積中の薬物量より十分に大きいことから、oseltamivirは血液脳関門を透過し、中枢神経系へ移行することを示した。P-gpを欠くMdr1a/1b-/-マウスではoseltamivirの脳-血漿濃度比の有意な上昇が認められ、Bcrp-/-マウスにおける脳-血漿濃度比は野性型マウスと同程度であった。すなわち、oseltamivirは血液脳関門においてP-gpによるくみ出しを受ける。一方Mdr1a/1b-/-マウスおよびBcrp-/-マウスにおいても、Ro64-0802の脳-血漿濃度比は野性型マウスと同程度であり、Ro64-0802の脳分布の低さはこれらトランスポーターによるくみ出しによるものではないことを示した。次に、oseltamivirによる有害事象は若年齢層での報告例が多いとされていることから、Wistarラット脳におけるP-gp発現量およびoseltamivirの脳分布に関する加齢依存性を検討した。幼若ラット(11日齢まで)では、成体ラットに比べてP-gpのmRNAレベル量およびタンパク量ともに低く、それに伴いoseltamivirの脳-血漿濃度比は有意に高いこと(6日齢まで)を明らかとしている。P-gpによる汲み出しが、加齢依存的なoseltamivirの中枢作用を説明できる可能性を示唆した。

Oseltamivir こと異なり、加水分解を受け、カルボキシル基が露出した活性他Ro64-0802の脳分布容積は毛細血管管腔内容積であり、ほとんど中枢神経系の移行は無視できる程度である。私が主宰する分子薬物動態学教室の伊藤らの解析によると、Ro64-0802は腎有機アニオントランスポーターOat3の基質となる。Oat3は脳毛細血管内皮細胞の脳側細胞膜に局在し、脳実質内からの異物排泄に働くことが示唆されてきたことから、Oat3によるくみ出しがRo64-0802の脳分布を制限している要因である可能性について検討した。野生型マウスおよびOat3-/-マウスにおけるRo64-0802の脳内からの排出速度を比較したところ、Oat3-/-マウスでは、大脳皮質からのRo64-0802の消失は顕著に遅延した。しかし、Oat3-/-マウスにおいても、24時間連続皮下投与後のRo64-0802の脳分布容積は脳毛細血管容積程度であった。そこで管腔側での排出トランスポーターによるくみ出しを仮定した。Mdr1a/1b-/-マウスおよびBcrp-/-マウスでは、Ro64-0802の脳-血漿濃度比は野生型と同程度であったことから、Oat3と同じく腎刷子縁膜に発現し尿中への薬物輸送に関わるMrp4が血液脳関門に発現していることに注目した。oseltamivirを2時間連続静脈内投与した後のRo64-0802の脳-血漿濃度比は、Mrp4-/-マウスの方がわずかながら高く、さらに24時間連続皮下投与することで、野生型マウスとの差はより顕著となった。また、Ro64-0802自身を24時間連続皮下投与した後の脳-血漿濃度比も同様の結果であった。この時間依存性は、Ro64-0802は極性が高く脂質膜透過能が高くないため、有意な蓄積を検出するために時間がかかるためと考察している。Ro64-0802の脳内からの排出速度も、Mrp4-/-マウスでは有意に遅延することを見いだしている。

以上の結果から、oseltamivirは血液脳関門を透過し、中枢神経系へと到達するものの、P-gpによる能動的なくみ出しを受け中枢移行性が制限されていること、そして幼若ラットでは血液脳関門におけるP-gpの発現量は成体ラットに比べて低いため、成体に比べてoseltamivirの脳曝露が高いことを明らかとした。また、Ro64-0802も血液脳関門を透過するものの、Mrp4による汲み出しを受けるためみかけ上中枢神経系の移行が認められないことを明らかにした。特に後者においては、Oat3とともに血液脳関門を介した経細胞輸送において方向性輸送を形成していることを明らかにした。血液脳関門の異物排出において、このように取り込みと排出のトランスポーターを同定したのは、本研究が初めてである。

Part-IIでは、血液脳関門に発現する有機アニオントランスポーターOatp1a4に焦点をあて、薬物輸送における重要性を解明した。Oatp1a4は能動的に薬物を細胞内へ取り込むトランスポーターであり、分子薬物動態学教室において、阻害剤を使い脳内からのアニオン性化合物の排出に働いていることを示唆する結果を報告している。申請者は、Oatp1a4-/-マウスを用いたin situ/in vivoでの試験で、血液から中枢神経系の移行、脳実質内から血液中への排出の両輸送過程に関わることを明らかにした。

Oatp1a4はラットでは脳側細胞膜に大部分局在していることが報告されているが、Oatp1a4はマウス脳毛細血管内皮細胞の脳側および血液側の両細胞膜に局在していることを免疫染色により明らかにした。安定発現系を用いたin vitro輸送実験により、pitavastatinをはじめとする種々アニオン性医薬品やdigoxinがOatpa1a4基質となることを示した。In vitroで基質となることが確認されたアニオン性薬物を大脳皮質に直接投与し、その消失速度を比較したところ、野生型マウスに比べて、Oatp1a4-/-マウスではpitavastatin、rosuvastatinおよびtaurocholateの消失は顕著に遅延し、pravastatinにおいても有意な遅延が観察された。これら化合物の脳内から血液方向への排出輸送は主にOatp1a4で説明可能であることを示している。さらに、in situ脳灌流法により脳取り込みクリアランスを測定したところ、pitavastatin、rosuvastatin、taurocholateおよびochratoxin Aの取り込みクリアランスはOatp1a4-/-マウスにおいて有意に低下した。これら化合物の血液から脳への輸送にはOatp1a4が関与する。すなわちOatp1a4は血液脳関門において、脳内からのアニオン性薬物の排出に働くだけではなく、血液中からの薬物の取り込みにも働くトランスポーターであることが明らかとなった。digoxinとDPDPEはOatp1a4基質であるにも関わらず、野生型マウスとOatp1a4-/-マウスでは、脳移行は同程度であった。これら薬物はP-gp基質となり、血液脳関門において能動的なくみ出しを受ける。そこでP-gp阻害剤GF120918を投与し、P-gp阻害時での脳移行をin situ脳灌流法により比較した。GF120918投与群ではdigoxinの取り込みクリアランスは顕著に増加していた。GF120918投与群では、Oatp1a4-/マウスにおけるdigoxinの取り込みクリアランスは野生型マウスに比べて有意に低く、P-gp阻害時ではOatp1a4を介した輸送が認められた。

以上の結果から、Oatp1a4は種々の化合物の脳内から血液の排出、血液から脳への輸送に関与するユニークな特性を有していることを明らかとした。また、digoxinなど、一部の薬物は管腔側での汲み出しのため、Oatp1a4を介した中枢移行が制限されており、排出トランスポーターがフィルターとして、中枢神経系へと送達する基質を選別している可能性を示唆した。Oatp1a4のヒトホモログOATP1A2は脳毛細血管の管腔側に発現していることから、OATP1A2は医薬品の脳内への取り込みに働き、薬効の増強あるいは中枢性の副作用の回避等、創薬への応用が可能であることを示している。

本研究は、血液脳関門における排出トランスポーターがoseltamivirおよびRo64-0802の脳内濃度を決定する要因となることを明らかにした。年齢や遺伝子多型等により生じるこれらトランスポーターによる排出輸送活性の個体間変動が、中枢応答性の個人間変動と関連しうる。また、血液脳関門において、多様な化合物を基質とすることができるOatp1a4が血液中からの薬物の取り込みに関与することを明らかにし、薬物の脳送達を可能とする標的分子の1つとなるものと期待される。

上記の通り、本研究は薬物動態領域の研究発展ならびに中枢性医薬品の創製および適正使用に大きく貢献するものであり、博士(薬学)の学位を授与するに値するものと認めた。