核内受容体(NR)はリガンド結合依存的に活性化される転写因子の大ファミリーを構成し，胚発生，分化細胞の表現型の維持，代謝および細胞死に関与する特定の標的遺伝子の発現を制御する．NRファミリーには，エストロゲン受容体(ER)，アンドロゲン受容体(AR)，プロゲステロン受容体(PR)，グルココルチコイド受容体(GR)のようなステロイド受容体；甲状腺ホルモン受容体，レチノイックX受容体，レチノイン酸受容体；およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)のようなオーファン受容体が含まれる．一般的に使用される医薬品の中にはNRの作用物質(アゴニスト)あるいは拮抗物質(アンタゴニスト)としてはたらくものがあり，たとえば，ERに結合するタモキシフェン(乳がん治療薬)，ARに結合するフルタミド(前立腺がん治療薬)，PPARγに結合するチアゾリジンジオン(2型糖尿病治療薬)，GRに結合するデキサメタゾン(炎症性疾患治療薬)が挙げられる．リガンドが結合したNRが効率的に転写制御を行うためには，転写共役活性化因子(コアクチベーター)タンパク質が必要である．リガンドが結合することによって，受容体のリガンド結合ドメイン(LBD)上に特徴的な高次構造の変化が引き起こされ，その結果コアクチベーターと受容体との結合が促進，もしくは妨害される．一次配列の比較，およびX線結晶構造解析の結果から，LBDの折りたたみ構造はすべてのNRファミリーにおいてほぼ共通していることが示唆されている．アゴニストがNRに結合すると，LBDの高次構造が変化してLBDの表面にコアクチベーター結合部位が露出する．続いてコアクチベーターがNRに結合して転写活性を促進する．対照的に，アンタゴニストが結合した場合には，LBDの高次構造変化によってコアクチベーターの結合が妨害される．コアクチベータータンパク質は，保存された疎水的なLXXLLモチーフ(Lはロイシン，Xは任意のアミノ酸を示す)を介して受容体と結合する．

　本研究では，ER，AR，およびPPARγについて，遺伝的にコードされた蛍光プローブの開発を行い，生細胞内において各受容体の内因性および外因性リガンドの評価を行った．

原理

　図1は，原理を模式的に示したものである．NRのLBDと，LXXLLモチーフを有するコアクチベーターペプチドとを，柔軟なリンカーで連結した．この融合タンパク質の両端に，シアン色蛍光タンパク質(CFP，ドナー)および黄色蛍光タンパク質(YFP，アクセプター)を連結した．CFPとYFPの励起および蛍光スペクトルは，CFPからYFPへの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に適したものである．アゴニストが結合することによってLBDの高次構造が変化し，コアクチベーターが受容体に結合する．続いてCFPがYFPに接近し，その結果FRETが増大する．一方，アンタゴニストが結合した場合にはLBDは先ほどとは異なる高次構造をとり，コアクチベーターは結合することができない．したがってFRETは起こらない．ER，AR，およびPPARγについてプローブを開発し，SCCoR(Single Cell-Coactivator Recruitment)と命名し，このプローブを用いて行うアッセイ法を蛍光SCCoRアッセイ法と命名した．リガンド依存的な受容体LBDの高次構造変化とコアクチベーターの結合をFRET顕微鏡を用いてリアルタイムに観察することにより，これらの受容体に対する天然および合成リガンド(アゴニスト，アンタゴニスト)のスクリーニングを行うことができた．

ERのSCCoR

　ER-SCCoRを作製するに当たり，ERのLBD(第305-550アミノ酸)とステロイド受容体コアクチベーター1のペプチド(HKILHRLLQEG)とを連結した．この融合タンパク質の両端にCFPとYFPを連結した．このプローブをCHO-K1細胞に発現させて，エストロゲン様物質のスクリーニングを行った．アゴニストである17β-エストラジオール(E2)の添加によって，CFP/YFP蛍光強度比が減少(FRETが増大)し，図2に示すように擬似カラー表示の上では青色シフトする様子が観察された．一方，同様の条件下でアンタゴニストであるICI 182，780を添加したときには，何の変化も起きなかった．内分泌かく乱物質(EDC)の多くはERに対して高い結合能を有している．図3に示すように，E2およびいくつかのEDC(ジエチルスチルベストロール[DES]，ゲニステイン[Gen]，ノニルフェノール[NP]，ビスフェノールA[Bis-A])について，濃度依存的な応答を測定してスクリーニングを行った．この結果から，E2>DES>Gen>NP>Bis-Aの順に結合能が低くなることが見出された．

　乳がんの治療において，天然エストロゲンE2の活性を抑えるために抗エストロゲン剤(ERのアンタゴニスト)が用いられることがある．そこで，アンタゴニストであるICI 182，780および4-ヒドロキシタモキシフェン(OHT)のE2活性抑制能についても評価を行った．ICI 182，780あるいはOHTの存在下では，E2活性は完全に抑えられた．またICI182，780あるいはOHTをE2で置換して活性を回復するためには，100倍の濃度のE2が必要であることが確かめられた(図4)．

ARのSCCoR

　アンドロゲンはARと結合して，生理学的には発生の段階における前立腺の形成に重要な役割を果たす一方，前立腺がんの発がんにも深く関与している．AR-SCCoRを作製するに当たり，ARのLBDとTip-60コアクチベーターのペプチドとを柔軟なリンカーで連結した．この融合タンパク質にCFPとYFPを連結し，顕微鏡下でFRETを観察した．DHTやテストステロンのようなアンドロゲン類の添加によってコアクチベーターはARに結合し，FRETが誘起された．一方，抗アンドロゲン剤であるフルタミドやプロシミドンを添加した場合にはFRETは起こらなかった．図5に示す通り，FRET応答はアンドロゲン濃度依存的であることが確かめられた．前立腺がんの治療において，天然アンドロゲンであるテストステロンをARのリガンド結合部位から解離させるために，フルタミドのような抗アンドロゲン剤を投与することがある．テストステロンがフルタミドによって置換される様子をSCCoRを用いて観察した結果を図6に示す．

PPARγのSCCoR

　PPARγは，がん，糖尿病，喘息，炎症性疾患などさまざまな病気を治療する上での分子標的となる．そこで，PPARγに対するSCCoRプローブを作製して，この受容体に対する内因性リガンドおよび外因性リガンド(2型糖尿病治療薬)のスクリーニングを行った．各種PPARγリガンドの添加によって得られた応答曲線を図7に示す．

結論

　本研究では，生細胞内においてさまざまなNRに対する内因性，外因性リガンドのスクリーニングおよび特性評価を行うための，蛍光プローブを用いたアッセイ法の開発を行った．このプローブは，リガンド濃度依存性からアゴニストの強弱を高感度に識別することができた．また，アゴニストとアンタゴニストの識別を効率的に行うことができた．本アッセイ法は高スループットで各種リガンドを評価することができるため，未知のリガンドがアゴニスト，アンタゴニスト，あるいは部分アゴニスト/アンタゴニストのいずれであるかを識別するのに適しており，乳がん，前立腺がん，炎症性疾患，および糖尿病治療薬の候補物質の開発，スクリーニングへの応用が期待できる．

Nuclear receptors(NRs) constitute a large family of ligand-activated transcription factors that regulate the expression of specific target genes involved in embryonic development,maintenance of differentiated cellular phenotypes,metabolism and cell death.The members of NRs family include steroid receptors such as estrogen,androgen,progesterone,glucocorticoid receptors(ER,AR,PR,GR);thyroid,retinoic X and retinoic acid receptors;and orphan receptors e.g.peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR).Pharmaceutical NR agonists and antagonists,such as tamoxifen for ER(targeted in breast cancer),flutamide for AR(targeted in prostate cancer),thiazolidinediones for PPARγ(targeted in type II diabetes)or dexamethasone for GR(targeted in inflammatory diseases),are among the most commonly used drugs.Coactivator proteins are required by ligand bound-NRs for efficient transcriptional regulation.Ligand binding to a receptor induces a distinct conformational change in the ligand binding domain(LBD)that facilitates or precludes coactivator interaction with the receptor.The sequence alignment and X-ray crystallographic studies suggest that all members of NR family share similar folding of their LBDs. An agonist binding to a NR induces a conformational change in the LBD that exposes a coactivator-docking site on the LBD surface.The subsequent recruitment of coactivator to the NR stimulates the transcriptional activity.In contrast,the conformational change in a NR LBD induced by an antagonist blocks the coactivator recruitment.A coactivator protein interacts with a receptor via a conserved hydrophobic LXXLL motif(L=leucine,X=any amino acid).

In the present study,genetically encoded fluorescent indicators for ER,AR,and PPARγ were developed for screening of their endo-and exogenous ligands in live cells.Principle.The principle is shown schematically in Figure 1.LBD of a NR was connected with a coactivator peptide that includes the LXXLL motif via a flexible linker.This fusion protein was sandwiched between cyan(a donor)and yellow(an acceptor)fluorescent proteins(CFP and YFP,respectively)in such a way that the excited and emission spectra of these fluorescent units are suitable for fluorescence resonance-energy transfer(FRET)from CFP to YFP.An agonist binding promotes coactivator recruitment by inducing a conformational change in the LBD that allows coactivator binding to the receptor.Subsequently CFP is oriented in the proximity of YFP that results in the FRET increase.By contrast,an antagonist binding induces a different conformation in the LBD,which is not favourable for coactivator interaction.Thus,the FRET does not occur.The indicators developed for ER,AR and PPARγ were named SCCoR(Single Cell-Coactivator Recruitment),and the assay was called as fluorescence SCCoR assay.Monitoring real-time ligand-induced conformational changes in the receptor LBD to recruit coactivator allowed screening of natural and synthetic ligands(agonists and antagonists)for these receptor in single living cells by FRET microscopy.

SCCoR for ER

To construct ER-SCCoR,the ER LBD(305-550 aa)was connected with a peptide(HKILHRLLQEG)of steroid receptor coactivator 1.This fusion protein then sandwiched between CFP and YFP.The screening of estrogens was done by expressing this construct in CHO-K1 cells.

Upon stimulation with an agonist,17β-estradiol(E2),a decrease in the CFP/YFP emission ratio(increase in the FRET)was observed along with the a blue shift of the pseudocolor in the cells images as shown in Figure 2,but no change was observed with the addition of an antagonist,ICI 182,780,under otherwise identical experimental conditions.Most of the endocrine disrupting chemicals(EDCs)have high binding affinity for ER.Screening of E2 and several EDCs(diethylstilbestrol,DES;genistein, Gen;nonylphenol,NP;and bisphenol A,Bis-A) was performed in a dose-dependent fashion as shown in Figure3.The results are as follows in their decreasing order:E2>DES>Gen>NP>Bis-A.

In the case of breast cancer management,the activity of natural estrogen E2 is inhibited by using the anti-estrogens(ER-antagonist drugs).The ability of estrogen antagonists such as ICI 182,780 and 4-hydroxytamoxifen(OHT)to inhibit E2 activity was also evaluated.The activity of E2 was inhibited completely in the presence of ICI 182,780 or OHT.A 100-fold higher concentration of E2 was required to displace ICI 182,780 or OHT in order to restore its activity(Figure 4).

SCCoR for AR

Androgens play a critical role not only in the physiological development of prostate but also in the genesis of prostate cancer by interacting with AR.For constructing AR-SCCoR,AR LBD was connected with Tip-60 coactivator peptide through a flexible linker.The resulted fusion protein was connected with CFP and YFP for FRET microscopy.Androgens such as DHT or testosterone promoted coactivator recruitment to the AR and induced FRET.But antiandrogens such as flutamide or procymidone were unable to promote FRET.Androgens promoted FRET in a dose-dependent manner as shown in Figure 5.In the case of prostate cancer management,the natural androgen testosterone is replaced from the ligand binding pocket of AR,which is done by using the antiandrogen drugs such as flutamide.The ability of flutamide to displace the testosterone was evaluated by using SCCoR indicator.The result is shown in Figure 6.

SCCoR for PPARγ

PPARγ is a molecular target for the treatment of several diseases such as cancer,diabetes,asthma,and inflammation.We extended our SCCoR approach to develop an indicator for PPARγ for the screening of endo-and exogenous ligands(drugs for typeII diabetes)for this receptor.The response curves for different PPARγ ligands were obtained as shownin Figure 7.In conclusion,we have devised a versatile fluorescence assay for screening and characterization of endo-and exogenous ligands for NRs in living cells.The high sensitivity of the present indicators made it possible to distinguish between strong and weak agonists in a dose-dependent fashion.Discrimination of agonists from antagonists was efficiently achieved using the present study.This fluorescence assay for ligands in a high-throughput manner can be used for classifying unknown ligands as agonists,antagonists or partial agonists/antagonists for NRs.The approach described here may be promising in the development and screening of potential drugs against breast cancer,prostate cancer,inflammation,and diabetes.

図1．　NR(ER，AR，およびPPARγ)のSCCoRの原理．LBDのヘリックス12の位置がリガンド依存的に変化することが，コアクチベーターの結合に重要な役割を果たす．

図2．(a)E2刺激時におけるCFP/YFP蛍光強度比の擬似カラー画像．(b)CHO-K1細胞にE2およびICI 182，780を添加したときのFRET応答の時間経過．

図3．ERのアゴニスト(E2，DES，Gen，NP，Bis-A)添加によるFRET応答の濃度依存性．

図4．アンタゴニストのE2活性抑制能．

図5．ARのアゴニスト添加によるFRET応答の濃度依存性．

図6．テストステロンによって誘起されたFRET応答が，抗アンドロゲン剤フルタミドの添加によって反転した

図7．ピオグリタゾン，15-デオキシ-Δ12，14-プロスタグランジンJ2，シグリタゾン，およびWy 14643添加によるFRET応答の濃度依存性．

Figure 1.Principle of the SCCoR indicator for NRs(ER,AR,andPPARγ).The ligand-induced positioning of helix 12 of LBD palys an important role for coactivator recruitment.

Figure 2.(a).Pseudocolor images of the CFP/YFP emission ratio upon E2 stimulation.(b)Time course of the FRET response upon addition of E2 and ICI 182,780 to CHO-K1 cells,respectively.

Figure 3.Dose-response curves for agonists(E2,DES,Gen,NR and Bis-A).

Figure 4.The ability of antagonists to inhibit the activity of E2.

Figure 5.Dose-response curves for AR agonists.

Figure 6.Testosterone induced ratio change was reversed back upon addition of an antiandrogen flutamide.

pioglitazone,15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2,(PGJ2),ciglitazone,and Wy 14643.

　本論文は5章より成る．第1章は序論であり，本論文の背景と化発した方法の原理について述べている．核内受容体(NR)のリガンド結合ドメイン(LBD)と，LXXLLモチーフを有するコアクチベーターペプチドとを，柔軟なリンカーで連結した．この融合タンパク質の両端に，シアン色蛍光タンパク質(CFP，ドナー)および黄色蛍光タンパク質(YFP，アクセプター)を連結した．CFPとYFPの励起および蛍光スペクトルは，CFPからYFPへの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に適したものである．アゴニストが結合することによってLBDの高次構造が変化し，コアクチベーターが受容体に結合する．続いてCFPがYFPに接近し，その結果FRETが増大する．一方，アンタゴニストが結合した場合にはLBDは先ほどとは異なる高次構造をとり，コアクチベーターは結合することができない．したがってFRETは起こらない．エストロゲン受容体(ER)，アンドロゲン(AR)，およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPARγ)について可視化プローブをこのような原理に基づき生細胞内蛍光可視化プローブを開発し，SCCoR(Single Cell-Coactivator Recruitment)と命名し，このプローブを用いて行うアッセイ法を蛍光SCCoRアッセイ法と命名した．リガンド依存的な受容体LBDの高次構造変化とコアクチベーターの結合をFRET顕微鏡を用いてリアルタイムに観察することにより，これらの受容体に対する天然および合成リガンド(アゴニスト，アンタゴニスト)のスクリーニングを行っている．

　第2章ではERのSCCoRプローブについて記述している．ER-SCCoRを作製するに当たり，ERのLBD(第305-550アミノ酸)とステロイド受容体コアクチベーター1のペプチド(HKILHRLLQEG)とを連結した．この融合タンパク質の両端にCFPとYFPを連結している．このプローブをCHO-K1細胞に発現させて，エストロゲン様物質のスクリーニングを行っている．アゴニストである17β-エストラジオール(E2)の添加によって，CFP/YFP蛍光強度比が減少(FRETが増大)することを見出している．一方，同様の条件下でアンタゴニストであるICI182，780を添加したときには，何の変化も起きないことを見出した．内分泌かく乱物質(EDC)の多くはERに対して高い結合能を有している．E2およびいくつかのEDC(ジエチルスチルベストロール[DES]，ゲニステイン[Gen]，ノニルフェノール[NP]，ビスフェノールA[Bis-A])について，濃度依存的なFRET応答を測定してアッセイ・スクリーニングを行っている．この結果から，E2>DES>Gen>NP>Bis-Aの順にコアクチベーターの結合能が低くなることが見出された．

　乳がんの治療において，天然エストロゲンE2の活性を抑えるために抗エストロゲン剤(ERのアンタゴニスト)が用いられることがある．そこで，アンタゴニストであるICI182，780および4-ヒドロキシタモキシフェン(OHT)のE2活性抑制能についても評価を行っている．ICI182，780あるいはOHTの存在下では，E2活性は完全に抑えられている．またICI182，780あるいはOHTをE2で置換して活性を回復するためには，100倍の濃度のE2が必要であることが確かめられた．

　第3章ではARのSCCoRプローブについて述べている．アンドロゲンはARと結合して，生理学的には発生の段階における前立腺の形成に重要な役割を果たす一方，前立腺がんの発がんにも深く関与している．AR-SCCoRを作製するに当たり，ARのLBDとTip-60コアクチベーターのペプチドとを柔軟なリンカーで連結している．この融合タンパク質にCFPとYFPを連結し，顕微鏡下でFRETを観察した．DHTやテストステロンのようなアンドロゲン類の添加によってコアクチベーターはARに結合し，FRETが誘起された．一方，抗アンドロゲン剤であるフルタミドやプロシミドンを添加した場合にはFRETは起こらないことを見出している．FRET応答はアンドロゲン濃度依存的であることが確かめられた．前立腺がんの治療において，天然アンドロゲンであるテストステロンをARのリガンド結合部位から解離させるために，フルタミドのような抗アンドロゲン剤を投与することがある．テストステロンがフルタミドによって置換される様子もこのSCCoRプローブを正確に観測されている．

　第4章では，PPARγのSCCoRプローブについて結果を述べている．PPARγは，がん，糖尿病，喘息，炎症性疾患などさまざまな病気を治療する上での分子標的となる．そこで，PPARγに対するSCCoRプローブを作製して，この受容体に対する内因性リガンドおよび外因性リガンド(2型糖尿病治療薬)のスクリーニングを行った．各種PPARγリガンドについてプローブの濃度/応答曲線を記録し考察を行っている．

　第5章では，本論文の結論を以下のようにまとめている．本研究では，生細胞内においてさまざまなNRに対する内因性，外因性リガンドのスクリーニングおよび特性評価を行うための，蛍光プローブを用いたアッセイ法の開発を行った．このプローブは，リガンド濃度依存性からアゴニストの強弱を高感度に識別することができた．また，アゴニストとアンタゴニストの識別を効率的に行うことができた．本アッセイ法は高スループットで各種リガンドを評価することができるため，未知のリガンドがアゴニスト，アンタゴニスト，あるいは部分アゴニスト/アンタゴニストのいずれであるかを識別するのに適しており，乳がん，前立腺がん，炎症性疾患，および糖尿病治療薬の候補物質の開発，スクリーニングへの応用が期待できる．

　これらは理学の発展に寄与する成果であり，博士(理学)取得を目的とする研究として十分であると審査員一同が認めた．なお，本論文は各章の研究が複数の研究者との共同研究であるが，論文提出者の寄与は十分であると判断する．

　従って，博士(理学)の学位を授与できると認める．