Abstract

Adiponectin is known to have suppressive effects on tumor growth and is thought to be a key molecule in the positive correlation between obesity and cancer. However, the detailed mechanisms regulating tumor cell activity have not been elucidated. In this study, I found that both full-length (f-Ad) and globular adiponectin (g-Ad) inhibited cell growth in colon cancer cell lines in glucose-containing medium, whereas it supported cell survival in glucose-deprived medium, with an increase in AdipoR1 and AdipoR2 expression. The latter effect of adiponectin in glucose deprivation was significantly inhibited by adding autophagy inhibitors, chloroquine, 3-MA or a combination of pepA and E-64d, suggesting that the effect to support cell growth was dependent, at least in part, on the induction of autophagy. The enhancement of autophagy was confirmed morphologically using GFP-LC3 fusion proteins under a fluorescence microscope using stably transfected DLD-1 cells expressing GFP-LC3. Western blot analysis revealed that adiponectin increased the expression of LC3-1, LC3-2, phosphorylated AMPKα and PPARα but decreased that of phosphorylated mTOR, IGF-1, phosphorylated Akt and phosphorylated PI3K in glucose-deprived medium. I conclude that adiponectin supports cell survival in glucose deprivation through enhancement of the autophagic machinery by AMPKα and PPARα activation and IGF-1/PI3k/Akt/mTOR pathway inhibition. The bimodal effects of adiponectin are thought to be clinically important in the pathophysiology of tumor development and progression.

Abbreviations:

(AMPK) adenosine monophosphate-activated protein kinase, (mTOR) mammalian target of rapamycin, (f-Ad) full-length adiponectin, (g-Ad) globular adiponectin, (CQ) chloroquine, (pepA) pepstatin A, (3-MA) 3-methyl adenine, (LC3) microtubule-associated protein 1 light chain 3, (GFP) green fluorescent protein, (PPAR) peroxisome proliferator-activated receptor, (IGF-1) insulin like growth factor, (Akt) serine/threonine kinase, (PI3K) Phosphatidylinositol 3-kinase.

脂肪細胞由来のアディポネクチンは生細胞に対して多様な作用を及ぼす事が知られている。本研究では、アディポネクチンの癌細胞の増殖に対する影響をグルコース濃度の異なる環境下で検討し、下記の結果を得ている。

1.三種類の大腸癌細胞DLD-1, HT29, Colon26の増殖をMTSアッセイで検討したところ、full-length adiponectin (f-Ad), globular adiponectin (g-Ad)ともに、4.5g/Lのグルコース濃度では、有意に増殖を抑制したが、グルコース0 g/Lの環境下では、逆に増殖を有意に促進し、1.0g/Lの低グルコース濃度でも同様の傾向が認められ、アディポネクチンはグルコース欠乏状態で癌細胞の生存を支持する作用を持つことが示された。

2.同細胞で、アディポネクチン受容体の発現を検討すると、グルコース0 g/Lでは、4.5g/Lのグルコース濃度の場合と比べて、AdipoR1, R2ともにその発現量が増強する傾向を認めた。

3.DLD-1細胞においてグルコース欠乏状態でのアディポネクチンの生存支持作用は、オートファジー阻害剤、3MA, chloroquine, E64d and pepstatin Aの三者によって有意に抑制されることが示された。

4.直接オートファジーを検出する目的でGFP-LC3を組み込んだDLD-1細胞を作成し、LC3のオートファゴソーム膜上へのclusteringを検討したところ、f-Adがグルコース欠乏状態でのオートファジーを促進する作用があることが確認された。また、f-AdによるLC3のclusteringが、オートファジーの早期段階を抑える3MAにて抑制されるが、後期を抑えるchloroquine,と E64d and pepstatin Aでは抑制されないことが確認された。この事実から、アディポネクチンはオートファジーの初期段階に働く事が示唆された。

5.DLD-1細胞においてアディポネクチンの情報伝達経路を検討したところ、グルコース欠乏状態でアディポネクチンはAMP-kinaseを活性化しあ、LC3, , PPAR alphaの発現を増強する傾向を示した、mTOR, Akt, PI3Kのリン酸化はむしろ抑制する方向に作用していた。また、IGF-1の発現も有意に抑制する事が示された。

以上、本論文はアディポネクチンが癌細胞の増殖に対して、グルコース濃度の違いによって全く相反する作用を及ぼすことが明らかとなった。これまでのIn vitroの研究では、アディポネクチンは癌細胞の増殖を抑制する事が報告されてきたが、グルコース欠乏状態では、アディポネクチンはmTOR, Akt, PI3Kの抑制を介してオートファジーを誘導し、結果として癌細胞の生存に有利な影響を及ぼす事が新たな現象が明らかとなった。本研究結果は、癌の発生、進展機構を考える上で重要な知見をもたらすだけでなく、今後の癌治療を構築する上でも大きな貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。