Ca(2+) is a pleiotropic second messenger that plays a key role in regulation of neuronal morphogenesis. Ca(2+)/calmodulin-dependent protein kinases (CaMKs) are good candidates as potential downstream effectors of Ca(2+) elevation in neurons. We previously found that distinct limbs of the CaMKK-CaMKI cascade were specifically implicated in determining the extent of either dendritic or axonal growth downstream of different growth guidance signals in cultured cortical neurons. A membrane-anchored CaMKIγ regulated dendritogenesis downstream of BDNF, while in contrast, cytosolic CaMKIα strongly promoted axonal outgrowth and arborization downstream of excitatory GABA. However the key molecular mechanisms controlling the dendritogenetic and axonogenetic selectivity of CaMKIγ and CaMKIα have not been addressed. Here I demonstrate the activation mechanisms of the CaMKIγ downstream of BDNF in developing cortical neurons. I found that BDNF selectively stimulated CaMKIγ-dependent dendritic growth and enhanced the maximal activity of CaMKIγ, but not CaMKIγ. The present in vitro study revealed that CaMKIγ was a privileged sensor for small Ca(2+) rises. Furthermore, distinctive substrate signatures were identified for CaMKIγ and CaMKIα based on peptide library profiling analysis. Thus, a lower Ca(2+) threshold for activation of CaMKIγ, in combination with an altered substrate specificity and a dendritic enrichment through raft anchoring, may be key molecular mechanism of CaMKIγ-mediated selective dendritogenesis downstream BDNF during development of immature cortical neurons.

カルシウム/カルモデュリン依存性蛋白リン酸化酵素群は、細胞内のカルシウム上昇伴い活性化する分子である。これまでに、大脳皮質発達期神経細胞において、CaMKIγが樹状突起伸展を制御し、一方、同じアイソフォームであるCaMKIαが軸索伸展を選択的に制御していることを明らかにしてきた。しかしながら、同じアイソフォームであるにもかかわらず、両酵素が、いかに樹状突起・軸索を選択的に制御しているのか、不明な点が多い。本研究は、樹状突起伸展に関わるCaMKIγの選択的な活性化について検証し、以下の結果を得ている。

1. CaMKIγ-KOマウス大脳皮質由来の培養神経細胞を用いて、BDNF依存的な形態変化を観察したところ、BDNF依存的な樹状突起伸展の消失を認めた。更に、初代培養細胞にCaMKIγもしくはCaMKIαを強制発現させ、免疫沈降により酵素を回収し、in vitroで活性を測定する実験系を確立した。BDNF刺激によって、CaMKIγが選択的に活性化し、また、CaMKIを活性化する上流のキナーゼであるCaMKKα,β -DKOマウス培養神経細胞では、その活性化ほとんど認められなかった。これらの結果から、BDNF-CaMKK-CaMKIγ-樹状突起伸展経路の存在を示唆した。

2. より詳細な生化学的解析を行うため、リコンビナント蛋白を作成した。バキュロウイルス蛋白発現系を用いて、各種リコンビナント酵素を発現させ、アフィニティーカラムならびにイオン交換カラムを用いることにより、リコンビナント酵素を精製した。SDS-PAGEで均一バンドであることを確認した。精製CaMKIγとCaMKIαは、CaMKKによるリン酸化によって最大活性を示した。

3. CaMKIγとCaMKIαのカルシウム/カルモデュリン依存性に違いがあるのか検討した。MBPを基質として、in vitroキナーゼアッセイを行い、さまざまな濃度のカルモデュリン存在下で、CaMKIγとCaMKIαのカルシウム依存性酵素活性を測定した。CaMKIγとCaMKIα共にベルシェイプ型のカルシウム依存性を示し、それぞれのカルシウム応答性に違いがあること見出した。CaMKIαに比べ、CaMKIγは、低濃度のカルシウム条件下において活性を有し、カルシウムに対するEC50も低いことが分かった。よって、低濃度のカルシウムで、CaMKIγが選択的に活性化することを示唆した。

4. リコンビナント酵素とペプチドライブラリーを用いて、CaMKIγとCaMKIαの至適リン酸化モチーフの同定をした。最適基質ペプチドを作成し、基質特異性を検討した。CaMKIγとCaMKIαの最適かつ選択性を示しうる基質ペプチド(Iγ-tideならびにIα-tide)を設計し、基質特異性を検討したところ、CaMKIγとCaMKIαは、それぞれの最適ペプチドを有意にリン酸化した。以上の結果から、CaMKIγとCaMKIαは、基質選択性が異なることが示唆された。

5. 最適基質ペプチドを用いて、カルシウム依存的活性を測定した。低濃度のカルシウム存在下におけるCaMKIγの選択的な活性化は、Iγ-tideを用いたときに認められた。したがって、低濃度のカルシウム依存的なCaMKIγ選択な活性化に基質特異性が必須であることが示唆された。

以上、本論文は、CaMKIγの酵素学的な解析から、大脳皮質発達期神経細胞において、BDNF刺激に伴ったCaMKK-CaMKIγカスケード依存的な樹状突起伸展に、低濃度のカルシウムによる特異的活性化や基質特異性が重要であることを示唆した。本研究は、カルシウムシグナリングにおける樹状突起伸展の分子メカニズムの解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。